Способ получения @ - N - ацетилглюкозаминидазы BacILLUS SUвтILIS ВКПМ В-2471 Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/125 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения очищенного бактериального ферментного препарата А-Н-ацетилглюкоза- минидазы, который можно использовать ,при исследовании карбогидразной части гликолипидных и гликопротеиновых веществ, при лечении лизосомальных болезней, как эталон при диагностике раковых заболевании.

Цель изобретения - увеличение выхода целевого продукта и упрощение способа получения бактериальной &-N- ацетилглюкозаминидазы.

CllOCOfi заключается И 01-,1- Н ЧИИ

биомассы Bacillus suhLilis ВКПМ В-2471 (G-38) ацетоном в соотношении 1:1, отделении се центрифугированием и суспендпрованип в буфере. Суспензию биомассы обрабатывают препаратом R-N- ацетилглюксИаминпдазы до перевода эк- зо-Р -М-апетидглюкозаминидаяы в растворимое состояние, потом гелем сЬосфа- та кальция, для образования которого вносят 8 об.7, хлористого кальция, фильтруют в присутствии 8 об. 7, сЬильт- роперлита. Полученный фильтрат обессоливают диафильтрацией, фермент очи- щают хроматографией на депротеинизи- рованном хитине, где сорбцию фермента проводят при рП 3,5.- 4,0, а элюцию при рН 4 - 10.

П р и м е р 1. Препарат выделяют из культуральной жидкости Bac.subti- lis G-38. Берут 6300 см3 культуральной жидкости с активностью 56 мед/см3 и осаждают биомассу 6300 см3 ацетона,

охлажденного до 10 С (соотношение 1:1)25 перлита и проводят фильтрацию. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Центрифугат отбрасывают .

Полученную биомассу с активностью 3200 мед/г суспендируют в 500 см3 фос-, фатного буфера (рН 7,0), добавляют Зг бактериальной Р -М-ацетилглюкоэаминидазы с активностью 10000 ед/г. Суспензию инкубируют в течение 2 ч при 20°С при перемешивании. Добавляют 80 мл 50%-ного раствора хлористого кальция, потом наливают 270 см3 на35

Дпя обессоливания и подготов фильтрата для хроматографии про дят диафильтрацию на проточной рафильтрационной установке, исп зуя УАМ-150 мембраны.

Процесс проводят следующим о разом.

В бачок заливают 600 см3 Фил включают насос, создают на ульт фильтрационном аппарате при пом регулирующего вентиля давление 0,15 МПа. Фильтрат циркулирует ультрафильтрационную ячейку и в щается в бачок, ультлэафильтрат кость, прошедшая через мембраны бирается в отдельный сосуд. Сна концентрируют исходный Фильтрат 320 см3, потом концентрированны фильтрат разбавляют 0,001 М уни 45 сальным буфером (рН 4,0) до исх объема и снова проводят диафиль цию.

сыщенного раствора фосфорнокислого трехзамещенного натрия (рН смеси 7,1) В качестве фильтрующего агента добав- ляют 8 об.% (40 г) фильтроперлита. Суспензию хорошо перемешивают и фильтруют под вакуумом. Получают 600 см3 фильтрата с В-N-ацетилглюкозаминидаз- ной активностью мед/см3. Выход по активности 61%.

Влияние условий обработки препаратом fJ-N-ацетилглюкозаминидазы на показатели процессов приведено в табл. 1. В примерах 1 - 5, результаты кото уых приведены в табл. 1, изучается влияние обработки биомассы хлористым кальцием и присутствия перлита на фильтрацию и диафильтрацию. Из табл.1 видно, что обработка биомассы 8 об //Ј хлористого кальция и добавление 8 об.% перлита дает лучшие результаты по фильтрации. Однако в диализиро- ванном Фильтрате образуется осадок.

,-

0

В примерах 6-9 суспензию биомасс: сначала обрабатывают разными кояпчг- ствами препарата ft-N-аиетитглюкозамн- ницазы, а потом - ранее подобранным оптимальным количеством хлористого кальция и перлита, затем подвергают фильтрации и диафильтрации. Обработка биомассы препаратом $ М-ацетилглюко- заминидазы в количестве от 2 до 4 г оказывает существенное влияние на диафильтрацию. Диализированный Фильтрат получают без осадка, а выход ft-N- ацетилглюкозаминидазы увеличивается в 2 раза.

На основе исследований приняты следующее условия фильтрации: суспензию биомассы обрабатывают в течение 2 ч препаратом /З-М-апетилглюкозамини- дазон в количестве 2 - 4 г, добавляют 8 об.% хлористого кальция и насыщенным раствором фосфорнокислого трехзамещенного натрия доводят рН смеси до 7,1, а потом вносят 8 об.%

перлита и проводят фильтрацию.

Дпя обессоливания и подготовки фильтрата для хроматографии проводят диафильтрацию на проточной ультрафильтрационной установке, используя УАМ-150 мембраны.

Процесс проводят следующим образом.

В бачок заливают 600 см3 Фильтрата, включают насос, создают на ультрафильтрационном аппарате при помощи регулирующего вентиля давление 0,15 МПа. Фильтрат циркулирует через ультрафильтрационную ячейку и возвращается в бачок, ультлэафильтрат (жидкость, прошедшая через мембраны) собирается в отдельный сосуд. Сначала концентрируют исходный Фильтрат до 320 см3, потом концентрированный фильтрат разбавляют 0,001 М универ- сальным буфером (рН 4,0) до исходного объема и снова проводят диафильтрацию.

По описанной схеме диафильтрацию проводят с шестикратным разбавлением исходного фильтрата. Низкомолекулярные вещества и соли переходят в фильтрат, а биополимеры с мол.массой более 100 тыс. дальтон остаются в концентрате. В результате этой операции получают прозрачный диализированный раствор фермента объемом 84 см3, активностью 1500 мед/см3, со степенью очистки 544 раз, выходом 47%.

16

Загружают кп.чпнку - допротеини- зированным хитином н объеме 50 см3 и уравновешивают универсальным буфером 0,001 М (рН 4,9). На колонку наносят 84 см3 дидиализированного раствора фермента. Далее проводят элюцию фермента тем же универсальным буфером (0,001 М) в градиенте рН от 4 до 10. ft-N-Ацетилглюкозаминидаза элюируется в диапазоне рН 4,2 - 7,0. Фракции объединяют и получают 69 см3 элюата с удельной активностью 1225 мед/г бел ка, степенью очистки 2245 раз, выходом 24%. Далее элюат лиофилизируют и получают 0,5 г препарата с удельной активностью 25 ед/мг белка.

Характеристики основных этапов выделения высокоочищенного фермента p-N-ацетилглюкозаминидазы представлены в табл. 2.

При использовании предлагаемого способа получения высокоочищенного препарата ft-М-ацетилглюкозаминидазы повышается выход в 10 раз, а также упрощается способ выделения благодаря обработке биомассы ферментативным, химическим путем и аЛинной хроматографии на хитине. При этом исключаются этапы центрифугирования, гель- фильтрации и ионной хроматографии.

71691

Формула

б р с т с- ния

1. Способ получения Я-N-ацетилгг козаминидазы Bacillus subtil is BKHM

гюозаминидазы JJacilJus suhtilis ИК.ПМ B-2471, включающим отделение биомассы центрифугированием, сугпендпропапмо ее з буфере, диаФильтрацню и хромато- графическую очистку, отличаю Щ и rt с я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и упрощения способа, биомассу перед центрифугированием осаждают ацетоном в соотношении 1:1, суспензию биомассы об5 рабатывают препаратом /3 -N-ацеггилглюко- заминидазы до перевода зкзо-/3-Н-аце- - тилглюкозаминидазы в растворимое сое- . тояние, затем гелемфоссЬата кальция полученный раствор фильтруют,а хромато0 графическую очистку проводят на депро- теинизированном хитине.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что для образования

5 геля фосфата кальция используют 8 об.А хлористого кальция.

3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что Фильтрацию ведут

0 в присутствии фильтроперлита в количестве 8 об.%.

Таблица 1

Т a б м и ц а 2

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения очищенного бактериального ферментного препарата, β - N - ацетилглюкозаминидазы, который можно использовать при исследовании карбогидразной части гликолипидных и гликопротеиновых веществ, при лечении лизосомальных болезней, как эталон при диагностике раковых заболеваний. Цель изобретения - увеличение выхода целевого продукта и упрощение способа получения бактериальной β - N - ацетилглюкозаминидазы. Способ заключается в осаждении биомассы BACILLUS SUBTILIS ВКПМ В - 2471 ацетоном в соотношении 1:1, отделении ее центрифугированием и суспендировании в буфере. Далее суспензию биомассы обрабатывают препаратом β - N - ацетилглюкозаминидазы до перевода экзо - β -N - ацетилглюкозаминидазы в растворимое состояние, потом гелем фосфата кальция, для образования которого вносят 8 об.% хлористого кальция, затем фильтруют в присутствии 8 об.% фильтроперлита. Полученный фильтрат обессоливают диафильтрацией, фермент очищают хроматографией на депротеинизированном хитине, где сорбцию фермента проводят при рН 3,5 - 4,0, а элюцию - при рН 4 - 10. При использовании данного способа выход высокоочищенного препарата β - N - ацетилглюкозаминидазы повышается в 10 раз. К тому же упрощается способ выделения целевого продукта благодаря обработке биомассы ферментативным, химическим путем и аффинной хроматографии на хитине. При этом исключаются этапы центрифугирования, гельфильтрации и ионной хроматографии. 2табл.

Кул туралъная жидкость

B.subuilis 030 6300 6,3 Суспензия биомассы 500320 Ферментативная и химическая обработка биомассы и фильтрация 580843 Диафильтрация 841500 Хроматография на хитине 6913920 Известный способ 4000023300 Выделение из B.subti- lis G-38 по схеме известного способа 2020156

1,0 51,0

100,0 91,0

55,6

35,8

24,0

2,1

3225,0

4,6