Способ выделения ферментов из растворов Советский патент 1975 года по МПК C07K1/30 

цссса ферментации биомассу отде-ляют, а фильтрат концеитрируют в вакууме до содержания сухих веществ 30-35%, затем в концентрат добавляют сульфат аммоиия в количестве 40-5О%. Смесь иеремешивагот, охлаждают до 7-9°С и регулируют pPi смеси в нределах 5,0-8,5. Затем добавляют флотагент (ж.идкие парафины) в количестве 0,1% к объему. Осадок фермента флотирует в течение 3-6 ч, а затем .маточный раствор сульфата аммония в количестве 0,8-0,9 об. сливают. Оста1вший.ся флотированный осадок перемешивают, к нему доба вляют 1,5-2 об. органического растворителя (этилового, изопропилового спирта или ацетона) и отделяют осадок сепарированием; флотагент удаляется lis ферментного осадка вместе с органическим растворителем. Сырой ферментный осадок высушивают одним из известных способов.

Маточиый раствор сульфата аммония утилизируют.

Пример 1. Получение очии1,ен11ого препарата нейтральиой протеазы.

Контроль.

Продуцент Вас. subtilis-mesenteric выращивают на жилкой питательной среде следуюн1сго состава, %:

Картофельный крахмал8

Кукурузный экстракт0,8

Магний сернокислый0,1

Дрожжи пивиые0,4

Кальций хлористый0,1

Двузамегцеииый фосфат аммопия 0,9 Водадо 1 л

Культивирование проводят при 37°С, постоя П1ом перемешивании и аэрации в течение 48 ч. По окопчаиии ферментации иа каждый кубометр культуральной жидкости добавляют 6 л аммиачиой воды 25%;-ной концентрации, 30 кг фильтроперлита и 10 кг хлористого кальция. Смесь тщательпо перемен ивают и скоагулироваииую биомассу отделяют па фильтрпрессе. Получают фильтрат культуралыю жидкости с протеолитической активпостыв 60 ед./мл (метод Лейляп-Фольгарда). Для выделсиия препарата фермепта к 1 м фильтрата культуральпой жидкости (содержание сухих псществ 5%) при -4-1°С и постоянном неремеnniBainiii добавляют 3 м этилового спирта крепостью 96°, охлажде(пюго до -г5°С и рН полученной с.меси 6,0. Смесь выдерживают 10 мин и центрифугируют, осадок высугапвают. При таком способе выделеппя выход фермента составляет 60%, по отнои1С1П1ю к актипиости 1чультурал1)ИОЙ жидкости.

Расчет выхода фермептного препарата с 1 м культуральной жидкости и расхода этилового спирта па 1 кг препарата.

.Лктиппость 1 м культуральной жидкости Л 60.10«ед. ПС.

Активность готового продукта П 600 сд/г.

Выход препарата ,6. Тогда весовой выхоч препарата В составит:

„ Л-к GO-lO.j).G

(Г ). -(.о«.

Прп этом расход этанола иа осаждение 1 кг препарата составит:

300 л.

Пример 2. Получение очищенного препарата нейтральной иротеазы по предлагаемому способу.

Процудент Вас. snbtilis-mesentericus выращивают на л идкой питательной среде следующего состава, %:

Картофельный крах.мал8

Кукурузпый экстракт0,8

Магиий сернокислый0,1

Дрожжи нивиые 0,4 .

Кальций хлористый0,1

Двузамещениый фосфат аммония 0,9 Водадо 1 л

Культивироваиие проводят при 37°С, постоянном иеремсшивапии и аэрации в течение 48 ч.

По окоича 1ии ферментации иа каждый 1 м культуральиой жидкости добавляют 6 л аммиачной воды 25%-ной коицеитрации, 30 кг фильтроперлита и 0 кг хлористого кальция. Смесь Т1цательпо переменшвают и скоагулировапнук) биомассу отделяют иа фильтр-прессе. Получают фильтрат культура.чьиой жидкости с протеолитической активностью 60 ед/мл (.метод Лейляи-Фольгарда), который используют для получения иренарата нейтральной иротеазы.

1 м фильтрата культуральной жидкости с содержаиисм сухих веществ 5% концентрируют в вакууме нри 28-30°С в 2 раза, при этом концентрация сухих веществ в концентрате достигает 10%, а объем фильтрата умепьишется до 500 л. К 500 л копцептрата добавляют 1 кг и 10 кг хлористого иатрия, после растворения солей концентрат охлаждают до -|-1°С. Для обеспечепня более полного осаи деиия ферментов этиловый спирт подпд,елачивают 25%-ным аммиаком до рН 7,5, затем его охлаждают до температуры 4-5°С. К 500 л охлаждеиного концентрата ири иостояниом иеремеи1нванин добавляют 1500 л охлаждег1ного Н1елочного спирта, смесь выдерживают 10 мни и иентрифулфуют, осадок высуишвают.

При таком способе выделения выход ферлснта составляет 80% но отпоикшию к актив11ОСТП культуральпой жидкости.

Расчет выхода фермеитно1о препарата с 1 м культуральпой и идкости и расхода этилового спирта иа 1 кг препарата.

Активность 1 м культурально1 жидкости А 60.10 ед. ПС.

Активность готового продукта П 600 ед/г.

Выход ирепарата К 0,80, тогда весовой выход препарата «В составит:

.-К 60 Л .8 В:- - - ,.Q-JQ, --80/«с-.

что на 30% вьпие, чем в контроле. При этом расход этапола иа осаждепие 1 кг ирепарата составит: 1500:80я; 20 л, что в 2,5 раза мепь1не. чем I. контроле.

Пример 3. Получение очип1еиного препарата нейтральной иротеазы. Контроль.

Продуцент Вас. siihtilis-mesentcricits пыра1циьают на жидкой питательной среде следующего состава, %:

Картофельный крахмал8

Кукурузный экстракт0,8

Магний сернокислыйО,

Дрожжи пивные0,4

Кальций хлористый0,1

Двузамещенный фосфат аммония 0,9 Водадо I л

Культивирование проводят при 37°С, ностоянном неременгавании н аэрации в течение 48 ч. По окончании ферментации на каждый кубометр культуральной жидкости добавляют (3 л аммиачной воды 25%-ной концентрации, 30 кг фильтронерлита и 10 кг хлористого кальция. Смесь тщательно неремешивают и екоагулирощаинуюбиомассу отделяют на фильтр-прессе. Получают фильтрат культуральной жидкости с нротеолитической активностью 60 ед/мл (метод Лейляи-Фольгарда). Для выделения преиарата фермента к 1 м фильтрата культуральной жидкости (содержаиие сухих вен;еств5%) нри -|-15°С и ностоянном неремегнивании добавляют 500 jcr сульфата аммония. После растворения соли смесь оставляют в нокое на 6 ч. Затем вынавищй осадок отделяют фильтрованием и высуишвают. При таком сиособе выделения выход фермента составляет не более 70% но отнонтению к активности культуральиой жидкости.

Расчет выхода фермеитного нренарата с 1м- культуральной жидкостт и расхода сульфата аммоиия на 1 кг нрепарата.

Активность

культуральнои жидкости

А 60-10ед. ПС. Активность roTOBOio нродукта П 600 ед/г. Выход нренарята 1 0,7. Тогда весовой выход иренарата «В составит:

00-10 -0,7

П -jp

При -JTOM расход сульфата аммония па нолученис 1 кг нренарата составит: 505:70 7,1 кг.

П р и м е р 4. Получение очииимпюго нренарата нейтральной нротеазы но нредлагаемому способу.

Продуие1гг Вас. subtilis-Hiesenlericiis выращивают на жидкой 1н-1тательной среде с.|1едуюHieiO состава, %:

Картофельньн крахмал8,0

Кукурузный экстракт0,8

Магний сернокислый0,1

Дрожжи иивиые0,4

Кальций хлористый0,1

Двузгкчкмцеииьп фосфат аммония 0,9

Водадо 1 л

Кулгливнрование нроподят нри 37°С, ностоя; 11ом нере еи1нваиин н аэрации в течение

48 ч.

По окоича1Н1н ферментации на ка/кд 1Й 1 м культурал1(1ой жидкости .добавляют G л аммиачной iio. концентрации, 30 кг (Ьмльтронерлита и 10 кг хлористого ка.. Смесь тщательно неремешивают и скоагули KM,ai:iiyio биомассу отделяют па фнльт1)-нрессе.

Получают фильтрат культуральиой жидкости с иротеолитической активиостью 60 ед/мл (метод Лейлян-Фольгарда), который иснользуют для нолучения нреиарата иейтральиой иротеазы. 5 IM фильтрата культуральной жидкости с со.аержаиием сухих веществ 5%, концент1)ируют в вакууме нри 28-30°С, доводя содержаиие сухих веществ в коицеитрате до 30-35%, а объем до 150-200 л. Затем к 200 л коицеитра0 та добавляют нри иостояииом иеремещиваиии 80 кг сульфата аммоиия. Смесь охлаждают до 8-10°С и для лучщего выиадения фермеита з осадок рН смеси аммиачной водой доводят до значения 8,0-8,5. Затем добавляют 200 мл

5 жидких иарафииов и осадок флотируют в течение 6 ч. По окоичаиии флотации осветвлен,ный маточный раствор сульфата аммония в количестве 180-200 л (9/10 об.) сливают. Фермеитньп осадок сусиеидируют в оставшихся

0 20 л II смешивают с 30-40 л этилового или изопроиилового сиирта. Получеииую смесь сеиарируют, ири этом флотагент удаляется из ферментного осадка вместе со спиртом. Отделенный ферментный осадок высушивают.

5 При таком способе выделеиия выход фермеита составляет 90% но отиошеиию к активности культуральиой жидкости.

Расчет выхода ферментного иренарата е 1 м культуральной жидкости и расхода суль0 фата аммония иа 1 кг цреиарата.

Активность 1 м- культуральной жидкости .10ед. ПС.

Активность готового иродукта П 600 ед/г. Выход нренарата ,9

б Тогда весовой выход нренарата «В составит:

60-uvjg,9

воо- То

В--П

что иа 28% вьине контроля.

При этом рас.ход сульфата аммония на iio.iyчение 1 кг готового нродукта составит:

80:90 6,9 кг, что в 8 раз MCHiiHic. чем в контроле.

П р и м е р 5. По.чучение очи1ценного препарата н.е,:1люлазы (контроль).

Продуцент целлюлазы TrichoderiHa uiride выращивают иа нитательной среде следующего состава. %:

Свекловнчный жом5

Сульфат аммония1

Однозаметенный фосфорнокислый калий0.2 Культивирование ироводят нрн ностоянпом неремешиваиии и аэрации в течение 6 суток нрн температуре 28-30°С. По окончании 1;ультивировагн1я биомассу отделяют фильтрацией, а фильтрат смеишвают с 50% сульфата аммоиия. После растворения соли выделившийся фермеит отделяют (1)и,1ьтрацией и выеуншвают в вакууме.

По даиному снособу выход нрепарата сот ставляет 42% к исходно активности ку.:1ьтурал1 иой жидкости. Расчет выхода ферментного препарата с 1м

культуралыюй л идкости и расхода сульфата аммония на I кг препарата.

Активность 1м культуралыюй жидкости А ЫО5ед. С.

АктивтЮсть готового продукта П 120 сд./г.С. Выход П:репарата 1 0,42. Тогда весовой выход препарата составит;

/VK МО-0.42 В -J- --- - |2бТ|03 этом расход сульфата ам.мопня па получешю 1 кг препарата составит: 500:3, кг.

П р и м е р 6. Получение очищеггного препарата целлюлазы ло предлагаемому способу.

Продуцент целлюлазы Trichoderma uiride вырапдивают на питательной среде следующего

состава; %:

С векл ов и ч I ы и жом Сульфат аммония Однозамещеппый фосфорно0,2 кислый калий Культивирование iпpoвoдят при исстоякном перемешивании и аэрации в течение 6 суток и температуре 28-30°С. По окончании культивирования биомассу отделяют фильтрацией. Фильтрат копцеитрируют в вакууме при температуре 28-30°С до содержания сухих веи;еств 20%. При этом Объем 1 м фильтрата уменьшается в 8-10 раз, т. е. коиечный обтаем концентрата составляет 100 л. Затем к 100 л концентрата прибавляют при постоянном неремешивании 50 кг сульфата ам.моння и 100 л жидких парафинов; осадок флотируют в течение 4 ч. По окончании флотации 90 л осветленного маточного раствора сливают, ферментный осадок суспендируют в оставшихся:10 л маточного раствора, смешивают с 20 л этилового или изопропилового спирта. Получеиную смесь сепарируют, при этом флотагент удаляется из ферментного осадка вместе со спиртом. Отделенный ферментный осадок высушивают. Выход фермента нри таком способе выделения составит 85%.

Расчет выхода ферментного препарата с 1 м культуральиой л идкости и расхода сульфата аммония на 1 кг препарата.

Активность 1 м культуральной жидкости ,O.IOS ед с.

8

Активность готового продукта П 120 ед/г. (;. Выход препарата К 0,85. Тогда весовой выход препарата составит: Л-к 1,0-10-0,75

в , 120. Ю- При этом расход сульфата аммония на получение 1 кг нрепарата составит: 50:7,1 7,00 кг, что в раз меньше, чем в контроле.

Предлагаемый способ позволяет повысить выход ферментного препарата до 80-90%, З1 ач11тельно увеличить степень его очистки и снизить расход этилового спирта на осаждение от 3 до 10 раз, расход сульфата аммония от 8 до 20 раз.

П р е д м е т и з о б р е т е п и я

1.Способ выдслення ферментов из растворов, например из фильтрата культуральной жидкости, нредуематривающий концентрирование растворов, например вакуум-вьшаривапнем, добавление в концентрат солей, например сульфата аммония, и отделение образовавптегося осадка, огли/аюы(айсятем, что, с целью повышения выхода ферментов и сокращения расхода осаждающих реагентов, после добавления солей в смесь вводят флотагент, декантируют, удаляют жидкую фазу и добавляют органический растворитель, предварительно охлаждеппый и нмеюн ий значение рН, равиое изоэлсктричсской точке выделяемого фермента.

2.Способ но н. 1, отличающийся тем, что в качестве флотагепта нснользуют жидкие парафины.

3.Способ по п. п. 1-2, отличающийся тем, что жидкие парафины вводят в количеетве 0,1 - 1% от объема смеси.

4.Способ но п. п. 1-3, отличающийся тем, что органический растворитель вводят в количестве 1-2 об. на I об. смеси.

5.Способ по п. п. 1-4, отличающийся тем, что перед добавлением флотагента смесь охлалчдают и рН устанавливают равным изоЗЛектрической точке выделяемого фермента.