Способ определения специфической сенсибилизации организма к аллергенам Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к клинической медицине, . точнее к клинической аллергологии и иммунологии, и предназначено для выявления специфической сенсибилизации к аллергенам у больных с аллергической патологией.

Цель изобретения - повышение точности определения специфической сен- сибилиза1 1и к аллергену.

Способ осуществляют следующим образом.

Моноциты и полинуклеары вьщеляют из периферической крови путем центрифугирования на двойном градиенте фиколл-верографин. После троекратного отмывания средой 199 клетки инкубируют в. концентрации 10 /мл s течение 60 мин в пробирках сапожках . Культуру клеток, прилипших к стеклу.

. 2

отмывают от лимфоцитов, добавляют аллергены (специфические и неспецифические), инкубируют в течение 45- 75 мин. Определяют индекс cyм apнoй люминесценции лизосом в моноцитах и клеточное соотношение Мц/Нф. При увеличении процента прилипших моноцитов более чем в 1,5 раза и повышении лизосо- мальной активности мононуклеаров более чем в 1,7 раза по сравнению с контропем диагностируют специфическую сенсибилизацию к аллергену.

Пример 1, Изучали способность моноцитов и нейтрофилов периферической крови больного бронхиальной астмой атопической формой отвечать на воздействие специфического аллергена (аллерген домашней пыли) in vitro. С этой целью вьщеляют граФ

00

нулоциты и мононуклеары из периферической крови путем це нтрифугирования на двойном градиенте фиколл-верогра- фин.

, На границе между плазмой и раствором фиколл-верографин образовалось кольцо, содержащее 10-15% моноцитов, 10-18% нейтрофилов, 67-80% лимфоцитов . После вьщеления клеточную взвесь - суспензию трижды отмывают средой 1Р9. Клетки инкуе5ируют в концентрации в течение 60 мин при 37 С в пробирках сапожках, на дне которых находились покровные стекла. Затем клетки, прилипшие к стеклу, отмьюают от лим зоцитов средой 199 и используют их для изучения специфической сенсибилизации к аллергену.

Исследование проводят двойным слепым методом. Испытатель и учетчик не знали, какой аллерген является специфическим. Клетки инкубируют в среде 199 с добавлелием 200 -РПИ/мл двух аллергенов, один из которых бьш специфическим (аллерген домашней пыли - опыт), а другой .неспецифическим (аллерген пыльцы деревьев - контроль 2). Общим контролем служили клетки, инкубированные без аллергена

0

5

0

5

(контроль 1) в течение того же времени. Специфичность аллергена подтверждалась многократными кожными пробами. По истечении срока инкубации и в опыте и в контроле подсчитывали соотношение моноцитов и-нейтрофилов, прилипших к стеклу (моноцит /нейтрофил) . В мазках подсчитывали не менее 100 клеток. В оставшихся сапо.жках клетки отмьтали от аллергена средой 199 и инкубировали с акридином оранжевым в концентрации 2 мкг/мп в течение 20 мин, после чего определяли суммарный индекс люминесценции (СИЛ) лизосом полуколичественным методом по формуле

СИЛ 1а + ЗЬ + 10с, где а

b количество клеток, содержащих единичные лизосомы; количество клеток, лизосомы в которых занимают 50-70% цитоплазмы;

колич.естйо клеток, цитоплаз-, ма которых полностью заполнена лизосомами.

30

Для облегчения учета реакции проводили подсчет индекса сенсибилизации (ИС) по формуле

соотношение Мц/Нф в опыте (или контроле 2)

соотношение в контроле 1

(или в контроле 2) СИЛ в контроле 1

где ИС - соотношение ютеточных элегг

ментов;

ИС - соотношение СИЛ лизосбм активных моноцитов.

У больного К.В.И. щ)оцент моноцитов в среде 199 составил 38%, со- ответственно М,/Нф 0,,61; при инкубации с неспецифическим аллергеном (смесь пыльцы деревьев): 47% моноцитов, а соотношение Мц/Нф 0,89; cd специфическим аллергеном (аллер- ген домашней пыли): 70% моноцитов, Нц/Нф 2,33. Соответственно ИС со специфическим аллергеном ИС 3,82, с неспецифическим аллергеном ИС .

СИЛ лизосом в моноцитах при инкубации в среде 199 составил 168 .ЕДр со специфическим аллергеном - 375 ЕД, с неспецифическим аллергеном -208.ВД.

Соответственно ИС со специфически аллергеном составил ИС 2,23, а с неспецифическим ИС - 1 ,24.

Пример 2. Больной Х.А.И. Диагноз: туберкулез легких.

ИзучсШи способность моноцитов и нейтрофилов периферической крови у больного в фазе выраженной активности процесса отвечать на воздействие специфического аллергена (туберкулина). Исследование проводили аналогично осуществлению способа в примере 1. В качестве специфического аллергена использовали стандартный сухой туберкулин.

Содержание ампулы разводили в 1 мл среды 199. В реакции использовали 0,1 МП полученного раствора туберкулина. Неспецифическим аллергеном служил бруцеллин (0,1 ми).

Процент моноцитов у данного больного в среде 199 составил 43%, соответственно Мц/Нф 0,75, при инкубации с неспецифическим аллергеном (бруцеллином) содержание моноцитов 53%, а соотношение 1,12, со специфическим аллергеном (туберкулином) - 76% моноцитов,Мц/Н ф 3,17.

ИС со специфическим аллергеном равен 4,2, ИС, с неспецифическим аллергеном равен 1,4.

СИЛ лизосом в моноцитах при инкубации в среде 199 составил 273 ЕД, со специфическим аллергеном 418 ЕД, а с неспецифическим аллергеном 306 ЕД Соответственно ИС со специфическим аллергеном составил 1,53, а с неспецифическим аллергеном 1,12.

Проведение исследований в соответ ствии с известным способом дало следующие результаты: при инкубации клеток в среде 199 для подсчета 100 лейкоцитов просмотрено 27 полей зрения, при инкубации с неспецифическим аллергеном - 44 поля зрения, при инкубации со специфическим аллергено м- 31 поле зрения.

Соответственно ИС со специфическим аллергеном составил 1,14, а с не специфическим 1,6.

Таким образом, известный способ не позволяет оце нить наличие специфической сенсибилизации, так как снижение прилипаемости более выражено с неспецифическим аллергеном, а не со специфическим. С помощью предлагае

0

5

0 5

о

5

мого способа можно точно определить, какой аллерген является специфическим. В данном примере специфическая реакция определяется на туберкулин, что соответствует иммунной реактивности при заболевании туберкулезом.

Положительньй эффект заключается в том, что уменьшается количество ложноположительных результатов с 40% до О, т.е. точность возрастает на 40%.

Формула изобретения

Способ определения специфической сенсибилизации организма к аллергенам, включающий забор крови, выделение лейкоцитов, инкубацию их в приг сутствии аллергена с последующей оценкой адгезивной активности лейкоцитов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, из лейкоцитарной взвеси вьще- ;ляют моноциты и нейтрофилы, инкубируют с аллергеном в течение 45-75 мин,, далее определяют процент прилипших моноцитов и нейтрофилов и лизосомаль- ную активность моноцитов и при увеличении процента прилипших моноцитов более чем в 1,5 раза при одновременном снижении процента прилипших нейтрофилов и Повышении лизосомальной активности моноцитов более чем в 1,7 раза по сравнению с пробой без аллергена диагностируют специфическую сенсибилизацию к аллергенам.