СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ АЛЛЕРГИИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/536 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для диагностики некоторых бактериальных инфекций и определения повышенной чувствительности (ПЧ) к микробным антигенам.

В литературе описано большое количество методов диагностики ПЧ к различным антигенам: внутрикожные пробы с соответствующими антигенами - реакции Бюрне, Манту, Шульц-Дейла, пассивной кожной анафилаксии (Беклемишев Н.Д., Суходоева Г. С., 1979; Адо А.Д., 1970; Каримов М.К., 1976). В этих же целях широко используются и пробирочные (in vitro) методы: реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), реакция бластной трансформации лейкоцитов (РБТД), реакция Райта, Хеддльсона, реакция связывания комплемента (РСК), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция повреждения (аллергической альтерации) нейрофилов крови (ППН по В.А.Фрадкину), реакция лейкоцитолиза, тест дегрануляции базофилов крови и др. (Ельчинова Е.А., Журба М.Д., 1971; Китаев М. И. , 1973; Фрадкин В.А., 1975; Авербах М.М., Беклемишев Н.Д., 1976; Bloom B., Glad F., 1976 и др.).

Приведенные выше методы при своей достаточно высокой информативности обладают и рядом недостатков:
1) пробы in vivo (внутрикожные) могут вызвать общие реакции даже на минимальные дозы аллергена; ценность кожных реакций (Бюрне) снижается и из-за положительных результатов после профилактического или лечебного введения вакцин;
2) для проведения пробы in vitro необходимо взять кровь (прокол кожи, венепункция). Эти серологические реакции выпадают положительными обычно в течение 4-6 месяцев от начала болезни, в хронический период они довольно часто бывают отрицательными или слабо положительными;
3) подавляющее большинство указанных реакций технически трудоемки, трудны для выполнения.

В качестве прототипа нами взят способ реакции лейкоцитолиза с лейкоцитами крови, описанный в "Прикладной иммунологии" под редакцией проф. Сохина А. А. и др., заключающийся в следующем: в пробирку с 0,02 мл 5% цитрата добавляют 0,08 мл крови и 0,01 мл специфического антигена (в контроле вместо антигена добавляют такое же количество изотонического раствора поваренной соли). После осторожного перемешивания подсчитывают в камере Горяева количество лейкоцитов в каждой пробирке: содержимое инкубируют в течение 2-х часов при 37^oC и вновь подсчитывают количество лейкоцитов. По разнице количества лейкоцитов до и после инкубации в опыте и контроле определяют интенсивность лизиса и степень сенсибилизации к специфическому антигену (наличие аллергии).

Целью настоящего изобретения является использование лейкоцитов слюны для диагностики бруцеллеза и повышенной чувствительности организма к антигенам бруцелл. Способ применим в этих же целях и при других инфекциях (токсоплазмоз, листериоз, туберкулез и др.).

Способ основан на способности сенсибилизированных лейкоцитов лизироваться в присутствии специфического (бруцеллезного) антигена.

Методика
Смешанную слюну собирали через 1,5-2 часа после еды и тщательного полоскания ротовой полости 0,85% раствором NaCl. Слюну в объеме 1-2 мл собирали в силиконированные мерные центрифужные пробирки, куда приливали 10 ед. гепарииа. Затем добавляли равный объем среды 199 и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин. Супернатант сливали и осадок ресуспендировали в объеме 0,5-1 мл.

Реакция лейкоцитолиза ставилась в 3-х пробирках (их количество можно увеличить, если используется большее количество антигенов), куда вносили по 0,05 мл взвеси лейкоцитов слюны. Затем в 1-ю пробирку добавляли 0,1 мл бруцеллина (опыт), во 2-ю - 0,1 мл туберкулина (контроль), в 3-ю - 0,1 мл среды 199 (контроль). После тщательного и осторожного (для предупреждения механического повреждения лейкоцитов) перемешивания в содержимом каждой пробирки подсчитывали количество лейкоцитов в камере Горяева. Пробирки помещали в термостат при t = 37^oC на 60 минут, встряхивая пробирки через каждые 15-20 минут. После инкубации вновь подсчитывали количество лейкоцитов в каждой пробирке. Определяли процент лизиса лейкоцитов и вычисляли индекс лейкоцитолиза (ИЛ) для каждого антигена по формуле
ИЛ = (L - L₁)_a - (L - L₁)_c/100,
где L - количество лейкоцитов в камере Горяева до инкубации;
L₁ - количество лейкоцитов в камере Горяева после инкубации;
а - в пробирке с антигеном;
с - в пробирке со средой 199.

Так как в инкубационной среде может оказаться разное количество лейкоцитов, лучше вычислять ИЛ по проценту лизированных клеток после инкубации (в опыте и контроле), т.е. выражая (L - L₁)_a ) и (L - L₁)_c в процентах.

По предлагаемому способу обследовано 78 больных бруцеллезом и 24 больных воспалительными заболеваниями пародонта (контроль). Кроме того, для оценки информативности реакция лейкоцитолиза ставилась и с лейкоцитами крови 52-х больных бруцеллезом с бруцеллином (специфический антиген) и токсоплазмином (неспецифический антиген).

В контроле (среда 199) у больных бруцеллезом процент лизиса лейкоцитов слюны после инкубации составил 14,14 ± 0,12%, что принято за отрицательный результат. В присутствии БЦЖ он был равен 15,09 ± 1,43% (ИЛ = 0,009), в бруцеллине 31,46 ± 1,79% (ИЛ = 0,017).

У больных с воспалительными заболеваниями пародонта процент лизиса лейкоцитов в присутствии среды 199 составил 4,7 ± 0,2%, БЦЖ - 9,9 ± 1,2% (ИЛ = 0,052), бруцеллина - 6,3 ± 0,6% (ИЛ = 0,016). Результаты расчета ИЛ приведены в таблице 1.

Процент положительных результатов при постановке РЛ с лейкоцитами слюны составил 86,8% при остром и 94,3% при хроническом бруцеллезе, с лейкоцитами крови соответственно 88,5% и 94,3%; с неспецифическими антигенами реакции были отрицательными.

Для оценки информативности способа приводится таблица 2, где указан процент положительных результатов, полученных разными способами.

Реакция лейкоцитолиза с лейкоцитами слюны из 68 случаев хронического бруцеллеза выпала отрицательной у 9 или 13,1%. Причем из 68 случаев хронического бруцеллеза выпала отрицательной у 9 или 13,1%. Причем у 6 из них все серологические реакции тоже были отрицательными (положительной была только проба Берне).

В то же время РЛ была положительной у 13 больных, когда антитела не были обнаружены, но кожная проба у них была положительной, т.е. чаще всего результаты РЛ совпадали с результатами пробы Берне. По данный М.И. Чернышовой и А. А. Строганова в РЛ с лейкоцитами крови специфический лизис лейкоцитов наступает в более ранние сроки (через 2 недели), чем кожная проба.

Дальнейшими исследованиями (Скаванский Ю.В., 1964, Касаткина М.А., 1967; Чернышева М. И. Строганов А. А. , 1970; Ельчинова Е.А., журба М.Д., 1971; Беклемишев Н.Д., Суходоева Г.С. и др., 1979) показана высокая специфичность реакции при бруцеллезе и других инфекционных заболеваниях.

Предлагаемый способ имеет преимущество перед другими:
1) нет необходимости взятия крови для исследования при сохранении высокой чувствительности;
2) прост в исполнении и нетрудоемок, особенно в сравнении с ППН;
3) позволяет выявить специфическую сенсибилизацию (через 2 недели) ранее, чем кожная проба;
4) позволяет многократно в короткие интервалы проводить исследования, что невозможно при внутрикожной пробе;
5) позволяет оценить тяжесть заболевания и степень десенсибилизации в результате лечения;
6) нет необходимости венепункции и прокола кожи, а следовательно, способ безопасен в отношении внесения инфекции.

Поэтому, при прочих равных условиях предлагаемый в качестве изобретения способ целесообразнее использовать в практической медицине.

Информация, принятая во внимание
"Прикладная иммунология", под редакцией профессоров Сохина А.А. и Чернушенко Е.Ф. - Киев. - Здоровья. - 1984, - с.51.

Изобретение относится к области медицины, а именно, к аллергологии. Способ основан на проведении реакции лейкоцитолиза с бруцеллезным антигеном. Наличие сенсибилизации организма выявляют при индексе лейкоцитолиза 0,1 и выше. При этом в качестве исследуемой жидкости используют слюну больного. Способ не инвазивен, прост, высокочувствителен. 2 табл.

Способ диагностики бактериальной аллергии, заключающийся в проведении реакции лейкоцитолиза у больных инфекционными заболеваниями и диагностировании наличия сенсибилизации организма к специфическому антигену при наличии индекса лейкоцитолиза 0,1 и выше, отличающийся тем, что при постановке реакции используют лейкоциты слюны, а в качестве специфического антигена используют бруцеллезный антиген.