Способ отбора препаратов микробных аллергенов для иммунодиагностики Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к стандартизации коммерческих аллергенов.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Для исследования берут коммерческий аллерген или экспериментальные производственные серии аллергенов.

Лимфоциты выделяют из периферической крови взрослых здоровых доноров и новорожденных (пуповинная кровь) на градиенте плотности фиколл-веро- графина (1,077 кг/ м ) центрифугированием при в течение 30 мин, дважды отмывают и ресуспендируют в среде 199 в количестве 3 млн.клеток на 1 мл. Моноциты удаляют инкубпнией лимфоцитов в пластиковой посуде в течение 60 мин при 37°С. Жизнеспособность клеток определяют по трипаново- му тесту (должно быть не менее 94% жизнеспособных клеток).

Лимфоциты взрослых доноров и лимфоциты новорожденных обрабатывают аллергеном в дозе 10 мкг/мл, инкубируя в термостате при 37°С 40 мин, затем их отмывают от несвязавшегося аллергена. Далее лимфоциты взвешивают в среде 199 и культивируют в течение 72 ч при 37°С (опытные пробы). .В контрольных пробах лимфоциты культивируют без обработки аллергеном в аналогичных условиях. Выделяют су- пернатант центрифугированием при 600xg в течение 20 мин. В опытных пробах смешивают 0,1 мл цельной крови от взрослых доноров и по 0,025 мл 0,2%-но го раствора нитросио

ЬЭ

vj

СО

со оэ

него тетразолия и супернатанта, полученного после культивирования клеток с аллергеном. В контрольных пробах используют супернатант, полученный после культивирования без аллергенов,

Указанные компоненты осторожно перемешивают, затем инкубируют пробы в течение 30 мин при 37вС. В дальнейшем иэ содержимого пробирок или лунок готовят мазки, высушивают, фиксируют в течение 5 мин в метаноле, ядра докрашивают 7-10 мин 2%-ным водным р аствором метилового зеленого, промывают и после высушивания микро- екопируют под иммерсией. Просматривают 100 клеток, результат выражают в виде процента нейтрофилов, содержащих при стимуляции грубодисперсные отло- жения диформазяна (восстановленная форма нитросинего тетразолия).Критерием стандартности исследуемых препаратов, а следовательно, их пригодности служат следующие показатели: при разнице в активности с супернатанта- ми (опыт-контроль) лимфоцитов взрослых выше 20 и отсутствии ее с супер- натантами лимфоцитов новорожденных препарат считают стандартным.

Пример 1. Коммерческий аллерген золотистого стафилококка (серия 12, ОКБ 471).

Лимфоциты выделяют ча градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 кг/м )« Концентрация лимфоцитов 3 млн.клеток на 1 мл. Затем смешивают равные объемы (по 1 мл) взвеси лимфоцитов и препарата аллергена (10 мкг/мл) и выдерживают 40 мин при 37°С (опыт). Отмывают от несвяэавше- гося аллергена, лимфоциты взвешивают в среде 199 и культивируют 72 ч при 37°С, В контроле лимфоциты культивируют без добавления аллергена в ана- логичных условиях. Затем смешивают 0,1 мл цельной крови и по 0,025 мл тестируемого препарата (супернатант культур) и 0,2%-ного раствора нитросинего тетраэолия. Паряллельно ставят опыт с супернатантами лимфоцитов взрослых и новорожденных. В контроле - супернатанты лимфоцитов взрослых и новорожденных, полученные из культур, не обработанных аллергеном. Ингредиенты реакции осторожно перемешивают и термостатирутот в -течение 30 мин при 37°С. Готовят мазки, высушивают, фиксируют, докрашивают их раствором

0 5 0 5 0

5 0 $

0

5

метилового зеленого, микроскопируют. Подсчитывают 100 нейтрофилов, определяя процент стимулированных клеток.

В опыте с супернатантом лимфоцитов взрослых доноров количество стимулированных клеток составляет 50, в контроле с супернатантом лимфоцитов взрослых доноров - 15. Разница между опытом и контролем - 35. В опыте с супернатантом лимфоцитов новорожденных количество этих клеток составляет 18, в контроле с супернатантом лимфоцитов новорожденных - 18. Разница между опытом и контролем - 0. Препарат в соответствии с предлагаемым способом считают стандартным.

П р и м е р 2. Маточный аллерген мукор пузилус на одной ич стадий технологического получения (серия 1, белок по Лоури 0,750 мкг/мл).

Порядок проведения исследования аналогичен описанному в примере 1 .

Разница между опытом и контролем с супернатантами лимфоцитов взрослых доноров составляет 17, а разница между опытом и контролем с супернатан- тачи лимфоцитов новорожденных равняется 2. Препаргт не являлся стандартным,

С помощью предлагаемого способа обеспечивается повышение точности на 35% (по известному способу выбраковывают 54% препаратов аллергена, а с помощью предлагаемого - только 5%),

Кроме этого, исключается необходимость введения препарата человеку при оценке его специфической активности. Это особенно важно для оценки качества препаратов на разных стадиях технологического процесса, так как введение таких препаратов нежелательно. При ггрименении предлагаемого способа можно ограничиться взятием донорской крови.

Формула изобретения

Способ отбора препаратов микробных аллергенов для иммунодиагностики, включающий забор крови от взрослых доноров, выделение лимфоцитов, инкубацию их с аллергеном, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, пополнительно производят забор крови из пуповинной кроьи новорожденных, выделяют лимфоциты, инкубируют их с аллергеном в

S1627993

дозе 8-10 мкг/мл, далее обе пробыактивностью нейтрофилов в пробах

центрифугируют и супернатантами об-и контроле без аллергена и при пока

рабатывают нейтрофилы крови взрослогозателях разницы показателя у взросдонора, выявляют их активность в реак-$л х выше 20 и отсутствии ее у новоции восстановления нитросинего тетра-рожденных препарат отбирают для им

эолия, вычисляют разницу междумунодиагностикн.

Изобретение относится к медицине, а именно к стандартизации коммерческих препаратов, Цель изобретения - повышение точности способа. У взрослых доноров и из пуповинной крови выделяют лимфоциты, которые инкубируют с аллергенами, центрифугируют и супернатянтами обрабатывают нёйтрофилы, выявляют их активность в реакции восстановления нитросинего тетразолия, вычисляют разницу в активности опытных проб и контроля Рез аллергена и при показателях разницы у взрослых выше 20 и отсутствии ее у новорожденных препарат отбирают для иммунодиагностики. В сравнении с известным способом точность отбора увеличивается на 35%.