СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АЛЛЕРГИИ К КОНКРЕТНОМУ АЛЛЕРГЕНУ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/533 

Изобретение относится к медицине, а именно аллергологии и иммунологии, и может быть использовано в практике клинических аллергологических и иммунологических лабораторий при оценке иммунного ответа на аллергены у взрослых и детей.

В медицинской практике оценку клеточного иммунного ответа к аллергенам проводят разными методами и различными биореагентами: методом твердофазного иммуноадсорбционного авторадиографического выявления антителообразующих клеток (АОК) с применением радиоактивно меченного антиглобулинового реагента (Д. Ф. Кирней. Радиоиммунный анализ. // Иммунология. Под. ред У. Пола М., - Мир, 1989. - С.260-261).

Недостатки: опасность загрязнения окружающей среды, возникающая при использовании реагентов, меченных изотопами; методическая сложность, связанная с необходимостью вырезать лунки из планшетов для оценки радиоактивности; необходимость защиты от излучения; ограниченное время жизни меченых реагентов.

Наиболее близким аналогом является способ иммуноферментных зон (ЭЛИСПОТ), позволяющий определять В-клетки, продуцирующие специфические антитела.

Способ осуществляют следующим образом. Из гепаризированной венозной крови человека выделяют лимфоциты центрифугированием в градиенте плотности фиколла - урографина. Полученные лимфоциты трижды промывают RPMI 1640 путем центруфугирования при 1000 об/мин в течение 10 мин и ресуспендируют в этом же растворе. В камере Горяева определяют концентрацию суспензии и доводят ее RPMI 1640 до 2-3•10⁹ в 1 мл. Сенсибилизируют аллергенами 24 -луночные планшеты, промывают от несор-бированных аллергенов. Лунки промытых планшетов обрабатывают раствором бычьего сывороточного альбумина и вносят суспензию клеток. Планшеты инкубируют в строго неподвижном состоянии в течение 3 часов. Затем клетки тщательно вымывают, вносят в каждую лунку конъюгированного с пероксидазой хрена иммуноглобулина против IgG или IgE человека и после инкубации вновь промывают. Готовят раствор ортофенилендиамина-субстрата для пероксидазы хрена, который смешивают с гелем агарозы и разливают в лунки, дают агарозе застыть и выдерживают при 20^oС 30 мин до появления коричневых пятен, соответствующих бывшему расположению В-клеток, продуцирующих антитела (Д. Гилберт, Д. Дрессер. Индукция и количественное определение клеток, образующих антитела in vitro// В кн.: Лимфоциты. М., - Мир, - 1990. С.201-205).

Недостатки: недостаточная чувствительность и воспроизводимость способа вследствие слабой иммобилизации аллергенов на твердой фазе, трудоемкость и сложность проведения анализа.

Изобретение направлено на решение задач: повышение чувствительности способа и упрощение способа.

Указанные задачи достигаются путем применения аллергенов, сорбированных на твердофазных планшетах, и меченых антиглобулиновых реагентов. Способ отличается тем, что в качестве аллергенов используют меченые корпускуляризованные аллергенспецифические диагностикумы (мКАД), сорбированные в лунках стрип-планшетов, к которым добавляют лимфоциты периферической крови (ЛПК) человека. Меченые корпускуляризованные аллергендиагностикумы представляют собой формалинизированные, танизированные эритроциты барана, сенсибилизированные определенным пищевым, бытовым, пыльцевым аллерегеном, меченным флуоресцентным красителем (флуоресцеин изотиоцианатом - ФИТЦ или тетрародамина изотиоцианатом - ТРИТЦ). Планшеты инкубируют в течение 1 часа 30 мин при температуре (37±2)^oС. Затем лунки стрипов промывают от ЛПК и вносят флуоресцирующие антивидовые иммуноглобулины. Планшеты выдерживают при Т(37±2)^oС в течение 30 мин, промывают от непрореагировавшего реагента и просматривают под объективом люминесцентного микроскопа. При анализе планшетов наблюдают локальную флуоресценцию мКАД в местах контакта со специфическими антителами, продуцируемыми В-клетками, что позволяет определять аллергию к конкретному аллергену.

Способ осуществляют следующим образом. Из гепаризированной венозной крови человека выделяют лимфоциты центрифугированием в градиенте плотности фиколла - урографина, взятых в соотношении 12:5. В центрифужную пробирку вносят 3 мл смеси градиента плотности и осторожно наслаивают 6 мл гепаринизированной крови (100 ЕД гепарина на 1 мл), предварительно разведенной RPMI 1640 в соотношении 1:1. Полученную смесь центрифугируют в течение 40 мин при 1500 об/мин, образовавшееся на границе разделяющего слоя и плазмы "лимфоцитарное кольцо" отбирают пастеровской пипеткой и трижды промывают RPMI 1640 путем центруфугирования при 1000 об/мин в течение 10 мин и ресуспендируют в этом же растворе. В камере Горяева определяют концентрацию суспензии и доводят ее RPMI 1640 до 2-3•10⁹ в 1 мл.

Используют плоскодонные стрип-планшеты для иммуноферментного анализа. В каждую лунку стрипов вносят по 100 мкл мКАД в концентрации 3% на карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ), рН 9,5, и инкубируют в течение 16-18 часов при 4-10^oС. Из гепаринизированной венозной крови выделяют ЛПК центрифугированием в градиенте плотности фиколлурографин, тщательно отмывают от следов плазмы и ресуспендируют при 4^oС в RPMI 1640 до концентрации 1-5•10⁶ клеток в 1 мл. Стрипы, сенсибилизированные мКАД, промывают 3 раза калий-фосфатным буфером (КФБ), рН 7,2. Для этого в лунки вносят 200 мкл этого раствора и через 2 мин вытряхивают содержимое из лунок одним резким движением. Затем в лунки добавляют по 200 мкл суспензии ЛПК и планшет инкубируют при (37±2)^oС в течение 1 часа 30 мин в строго горизонтальном положении. По истечении времени инкубации клетки удаляют путем трехкратного промывания лунок КФБ, содержащим 0,05% твина 20 (КФБ-твин). Затем в отмытые лунки вносят по 100 мкл флуоресцирующих иммуноглобулинов против иммуноглобулинов G человека или IgЕ, выдерживают 30 мин при (37±2)^oС с последующим трехкратным промыванием лунок КФБ-твином. Промытые стрипы просматривают в люминесцентном микроскопе и при выявлении зон локальной флуоресценции мКАД определяют аллергию к конкретному аллергену.

При продукции В-клетками специфических антител к соответствующим аллергенам наблюдается специфическая флуоресценция ободка у эритроцитов.

Оценку интенсивности флуоресценции проводят по четырехкрестовой шкале:
4+ - изумрудная, зеленого цвета флуоресценция ободка вокруг эритроцита;
3+ - яркая зеленого цвета флуоресценция ободка вокруг эритроцита;
2+ - зеленого цвета флуоресценция ободка вокруг эритроцита;
1+ - слабая, едва заметная флуоресценция ободка вокруг эритроцита;
- отсутствие флуоресценции.

Ориентировочное значение степени интенсивности флуоресценции при сенсибилизации организма аллергенами:
4+ - очень высокая степень сенсибилизации;
3+ - высокая степень сенсибилизации;
2+ - средняя степень сенсибилизации;
1+ - низкая степень сенсибилизации;
- отсутствие сенсибилизации.

Постановка реакции должна сопровождаться следующими контролями:
1. Заведомо положительный контроль аллерген + стандартная сыворотка к данному аллергену + флуоресцирующие антиIgЕ-антитела. Наличие 4+ - 3+ флуоресценции.

2. Заведомо отрицательный контроль: пыльцевой аллерген + исследуемая сыворотка + флуоресцирующие антиIgЕ-антитела. Отсутствие флуоресценции.

3. Контроль конъюгата: аллерген + флуоресцирующие антиIgE-антитела. Отсутствие флуоресценции.

Продолжительность реакции 1 час 30 мин.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Больная С. 11.06.90 года рождения. Обратилась с жалобами на зуд глаз и носа, чихание, слезотечение, водянистое отделяемое из носа в большом количестве в утреннее время круглогодично, в летнее время (июнь-июль) после прогулки в сухую, солнечную, ветреную погоду, эпизоды бронхообструкции после физической нагрузки, уборки по дому.

В момент осмотра состояние удовлетворительное. Кожные покровы чистые. Зев без гиперемии. Лимфоузлы не увеличены. ЧД 28 в 1 мин. ЧСС 88 в 1 мин. Дыхание жесткое, сухие, свистящие, рассеянные над всей поверхностью легких хрипы. Перкуторный звук с коробочным оттенком. Тоны cor ясные, ритмичные. Живот мягкий, безболезненный.

Обследование.

Спирография: есть риск по снижению ФЖЕЛ на границе условной нормы. Умеренная обструкция на уровне средних бронхов. Время выдоха увеличено. Проба с бронходилятатором положительная.

Индекс местной эозинофилии (ИМЭ) 84,38.

Скарификационные кожные пробы (СКП): клещ домашней пыли D. pter. (КДП) 2+, перо подушки (ПП) 2+, домашняя пыль (ДП) 2+, библиотечная пыль (БП) 2+ - сделаны через 14 дней после обострения.

Общий IgE 925 ME/мл.

Непрямой метод флуоресцирующих антител (нМФА):
КДП D. pter. - 3+, шерсть кошки 3+, ПП 2+.

Способ иммунофлуоресцентных зон при проявлении флуоресцирующими иммуноглобулинами против IgE выявил наличие флуоресцирующих зон локального связывания антител с аллергенами КПД, ДП, ШК.

Диагноз: бронхиальная астма, атопическая, период обострения. Аллергический ринит, персистирующий, обострение. Аллергический конъюнктивит, интермиттирующий, обострение. Бытовая эпидермальная сенсибилизация (аллергия).

Пример 2.

Больная Т., 12.06.89 года рождения. В момент обращения жалоб не предъявляла.

Из анамнеза известно, что в утреннее время периодически появляется зуд носа, многократное чихание с обильным водянистым отделяемым из носа.

При осмотре. Состояние удовлетворительное. Зев спокойный. Лимфоузлы не увеличены. Дыхание везикулярное, хрипов нет. Тоны cor ясные, ритмичные. Живот мягкий, безболезненный.

Обследование. Спирография. Вентиляционная способность легких (ВСЛ) слегка снижена по рестриктивному типу. Время выдоха (ВВ) нормальное. Проба с бронходилятатором отрицательная.

ИМЭ 7,6
Общий IgE 100 МЕ/мл.

Специфический IgE: коровье молоко (KM) 2+, цельное куриное яйцо (ЦКЯ) 2+, мясо курицы (МК) 3+, шерсть кошки (ШК) 1
нМФА: ШК 1-2+, KM 1+, ЦКЯ 2+, желток (ЖЯ) - 0.

Способ иммунофлуоресцентных зон при проявлении флуоресцирующими иммуноглобулинами против IgG человека и против IgE человека выявил наличие флуоресцирующих зон локального связывания антител с аллергенами КПД, ДП, ШК, что указывало на продукцию В-клетками специфических антител к этим аллергенам и наличие сенсибилизации в стадии ремиссии.

Диагноз: аллергический ринит, интермиттирующий, ремиссия.

Аллергический конъюнктивит, интермиттирующий, ремиссия.

Эпидермальная, пищевая сенсибилизация (аллергия).

Пример 3.

Обследование при поступлении на работу.

Жалобы не предъявляет. Проходит медосмотр в связи с поступлением на работу.

В момент осмотра состояние удовлетворительное. По внутренним органам без отклонений.

Проведено исследование крови: лейкоциты - 6800, палочкоядерные нейтрофилы - 2, сегментоядерные нейтрофилы - 48, эозинофилы - 2, моноциты - 5, лимфоциты - 43, иммуноглобулины классов: IgG (г/л) - 16, 9, IgA (г/л) - 2,6, IgM (г/л) - 1,28, IgE (ME/мл) - 80.

Способ иммунофлуоресцентных зон при проявлении мечеными иммуноглобулинами против IgG человека и против IgE человека не выявил наличия флуоресцирующих зон локального связывания антител с аллергенами КПД, ДП, ШК, что указывало на отсутствие сенсибилизации.

Диагноз: практически здоров. Годен для работы в лаборатории.

Положительный эффект. Способ позволяет повысить чувствительность за счет использования стрип-планшетов, сенсибилизированных мКАД, а применение флуоресцирующих антиглобулиновых реагентов позволяет упростить способ диагностики аллергии.

Изобретение относится к области медицины, а именно к аллергологии и иммунологии, и может быть использовано при диагностики аллергии. Сущность способа: в стрип-планшеты, сенсибилизированные мКАД, добавляют лимфоциты периферической крови, планшеты инкубируют при (37±2)^oС в течение 1 ч 30 мин, промывают от клеток, затем в лунки вносят флуоресцирующие иммуноглобулины против иммуноглобулинов G человека или иммуноглобулинов Е человека, выдерживают 30 мин при (37±2)^oС, трехкратно промывают лунки, отмытые стрипы просматривают в люминесцентном микроскопе и при выявлении зон локальной флуоресценции мКАД диагностируют аллергию к конкретному аллергену. Техническим результатом является повышение чувствительности и упрощение способа.

Способ диагностики аллергии к конкретному аллергену путем применения аллергенов, сорбированных на твердофазном планшете и меченых антиглобулиновых реагентов, отличающийся тем, что в качестве аллергенов используют меченые корпускуляризованные диагностикумы (мКАД), к которым добавляют лимфоциты периферической крови, планшеты инкубируют при Т (37±2)°С в течение 1 ч 30 мин, лунки промывают от клеток, затем вносят флуоресцирующие иммуноглобулины против иммуноглобулинов G человека или иммуноглобулинов Е человека, выдерживают 30 мин при Т (37±2)°С, 3-кратно промывают лунки, отмытые стрипы просматривают в люминесцентном микроскопе и при выявлении зон локальной флуоресценции мКАД диагностируют аллергию к конкретному аллергену.