Колонка для жидкостной хроматографии и способ ее заполнения Советский патент 1989 года по МПК G01N30/06 

1

Изобретение относится к области аналитического приборостроения и может быть использовано в химической, медицинской, биологической-и других отраслях промышленности для анализа

см

сложных смесей веществ методом высокоэффективной жидкостной хромато- гр афии.

. Цель изобретения - повьшхение скорости хроматографирования, разрешающей способности колонки и обеспечение прямого анализа сыворотки и других компонентов крови.

На фиг. 1 показан график, иллюстрирующий определение объема элюиро- ванного пика (V) и ширины пика (W) для последующего расчета эквивалентной высоты теоретической тарелки колонки; на фиг. 2 - хроматограмма раз- о виниладипата (имеющего чистоту более деления коммерческой смеси тирогло-99%), 200 г н-бутилацетата, 6,4 г

поливинилацетата (имеющего степень полимеризации 500) и 1 г 2,2 -азобисбулина, альбумина, миоглобина и фе- нилаланина; на фиг. 3 - хроматограмма разделения нормальной человечесизобутиронитрила при 70 С в течение

кой .сыворотки; на; фиг. 4 - хромато- 15 20 ч в 1,2 л воды, содержащей грамма разделения человеческой сы- мас.% поливинилового спирта как

воротки при почечном нарушении; настабилизатора суспензии для получения

фиг. 5 - хроматограмма разделенияполидивиниладипата. После завершения

человеческой сыворотки при различных полимеризации образовавшиеся гранулы скоростях потока элюента.20 выделяют фильтрованием, промывают водой, затем метанолом и сушат. ЗагруХромато графическая колонка содер- гранулы в круглодонную колбу

жит корпус диаметром 4-50 мм и длиной емкостью 2 л вместе с 1 л метанола, 100-600 мм, заполненный слоем полно-содержащего 32 г гидроокиси натрия,

стью пористого гидрофильного геля, в 25 смесь нагревают при перемешивании состав которого входят фрагменты 40 С в течение 24 ч. После завершения реакции отфильтровывают полученные гранулы и промывают их менилового спирта. Гель имеет средне- весовой диаметр гранул 4-20 мм, величину влагоудерживания 0,6-2,0 мл/г и концентрацию гидроксильных групп 3-15 мэк/г. .

Гельньй слой имеет степень однородности 2,0-4,0, которая определяется через отношение ЭВТТ/Др, где

танолом, а затем ацетоном.

30

Полученные таким образом гранулы поливинилового спирта загрзтеают в крупподонную колбу вместе с жидкой смесью, содержащей 350 мл диметил сульфоксида, 350 мл ацетона, 37 г

ЭВТТ 03начает эквивалентну 7высоту 35 пихлоргидрина и 16 г гидроокиси нат- теоретической тарелки предлагаемой смесь нагревают при перемешиваколонки, а Др - средневесовой диаметр ™ Р ° течение 24 ч. После гранул. Упаковочное отношение слоязавершения реакции гранулы отфильт0,66-0,78 и определяется по формулеРовывают и последовательно промывают

у40 водой, а затем ацетоном. Поп- , где V - объем воды с наружнойвторяют еще раз операции фгшьтровастороны гранул; V - общий объем ко-кия, про№шки и реакцию аналогично

лонки. Заполнение колонки осущест-описанному по такой же методике.

вляется следующим образом. Готовит-Полученные гранулы нагревают при

ся гелъная суспензия, содержащая 80 С в течение 24 ч при перемешивании 4,0-кратное количество геля, котороевместе с I н. водным раствором гиднеобходимо для заполнения колонки. Суспензию подают в загрузочную аппаратуру с последующей ее герметизацией. Аппаратуру подсоединяют к колонке, на концах которой установлены фитинги с фильтрами. Заполнение колонки суспензией осуществляют потоком жидкости, который подают с постоянной скоростью 0,2-1,5 м/ч в

50

роокиси натрия, после чего гранулы тщательно промывают водой.

Определяют средний диаметр полученных таким образом гранул, используя Coulter Counter Model ZB (торговое название.прибора, производимого и выпускаемого Каултер Электронике Инк., США). Средний диаметр гранул 12,3 рм, а величина W 1,75 мл/г объеме 1-300 внутренних объемов ко-Часть полученного геля вводят в релонки. Затем скорость потока увеличивают, обеспечивая среднее увеличение давления от 2 до 80 кг/см /ч и мак- |

акцию с уксусным ангидридом при 90 С в пиридиновом растворителе и при расчете концентрации гидроксильсимапьное увеличение давления до 60 кг/см /мин.

После заполнения отсоединяют колонку от загрузочной аппаратуры и фиксируют гельный слой фитингом с фильтром на верхнем конце колонки.

Пример 1. Подвергают суспензионной полимеризации смесь 80 г диизобутиронитрила при 70 С в течение

танолом, а затем ацетоном.

роокиси натрия, после чего гранулы тщательно промывают водой.

Определяют средний диаметр полученных таким образом гранул, используя Coulter Counter Model ZB (торговое название.прибора, производимого и выпускаемого Каултер Электронике Инк., США). Средний диаметр граакцию с уксусным ангидридом при 90 С в пиридиновом растворителе и при расчете концентрации гидроксиль51Д

ных групп (Чоч) геле из количества прореагировавшего уксусного анп1дри- да находят, что величина q равна

Oh

9,I мэк/г.

Погружают 10 г (сухой вес) полученных таким образом гранул на всю ночь в 100 мл дистиллированной воды для набухания. Монтируют первый концевой фиттинг, снабженный фильтром с диаметром пор 5 (u м, на одном конце колонки с внутренним диаметром 7,5 мм и 500 мм длины, а другой открытый конец колонки соединяют с з а- грузочным устройством с внутренним объемом 100 мл. Загрузочное устройство снабжено в его верхней части загрузочным отверстием для пасты геля и загрузочным отверстием для жидкости для заполнения, которое связано с загружающим насосом патрубком из нержавеющей стали, и манометром. Загрузочное устройство может быть герметизировано после заливки в него пасты геля. Упомянутую пасту геля тщательно диспергируют в течение 10 мин с помощью ультразвуковой очищающей машины (Branson В-12 тип, выпускаемой и продаваемой Брансон Кли- нинг Эквипмент Компани, США) и выливают в загрузочное устройство чере загрузочное отверстие для ласты геля. Затем в течение 60 мин пропускаю дистиллированную воду (жидкость для заполнения) через загрузочное устройство, и колонку со скоростью потока 1,0 мл/мин (ЛС (линейная скорость .1,36 м/ч).После этого увеличивают скорость потока дистиллированной воды при среднем увеличении давления со скоростью 20 кг/см /ч в слое геля и при максимальной скорости увеличения давления 20 кг/см /мин в.слое геля до тех пор, пока манометр не покажет 85 кг/см. Затем пропускают дистиллированную воду в течение 3 ч, выдерживая при этом давление на манометре 85 кг/см% контролируя количество слоя дистиллированной воды с помощью насоса. После прекращения пропускания дистиллированной воды колонку отсоединяют от загрузочного устройства и присоединяют второй концевой фиттинг, имеющий такую же конструкцию, что и первый концевой фиттинг, на открытый конец колонки. Итак, заполнение колонки закончено. Полученная колонка имеет величину ЭВТТ/Ду 3,3, а величину V. /V 1,54

58

и исключительн1. гфеде.п молекулярного веса (считая на декстран) около 2000000.

Проявляют на полученной колонке водный раствор коммерческих тирогло- булина, альбумина,миоглобина и фенил- анина, злюируют 0,05 мол/л фосфорнокислым буфером (рН 6,7), содержа- 0 PJJiM сульфат натрия и концентрации 0,2 мол/л при скорости потока 1 ,0 мл/мин. Вещества могут быть разделены очень эффективно (фиг. 2), вымываясь в порядке молекулярного ве- 5 са. Время анализа состакпяет только около 20 мин.

П р и м е р 2. Загружают жидкую смесь 100 г винилацетата, 32,2 г триаллилизоцианурата (X - числ о: 0 0,25), 100 г н-бутилацетата и 3,3 г 2,2 -азобисизобутиронитрила в цилиндрическую колбу емкостью 2 л вместе с 0,8 л воды, содержащей 1 мас.% поливинилового спирта как стабилиза- 5 тора суспензии, полученную смесь перемешивают до образования стабильной суспензии. Затем суспензию нагревают при 65°С в течение. 18 ч, а затем при 75 С в течение 5 ч при перемеши- 0 вании для проведения суспензионной полимеризации. После завершения полимеризации отфильтровывают образовавшиеся гранулы, прок1ывают их водой, а затем метанолом и сушат. Гранулы 35 загружают в круглодонную колбу емкостью 3 л вместе с 2 л метанола, содержащего 47 г гидроокиси натрия, полученную смесь нагревают при перемешивании при 15 с в течение 20 ч 40 для осуществления реакции переэтери- (икации. После этого проводят седи- ментационную классификацию в воде, получают гели (Д |.. 9,8 мм, Др/Дп Полученные гели имеют концентрацию 45 гидроксильньгх групп 7,3 мэк/г и величину W(f 1,58 ьш/г.

Затем отвешивают из геля три пор- ции по 7 г (сухой вес). Каждую из трех порций погружают на ночь в ЮОмп 0,2 мол/л водного раствора сульфата натрия и диспер1Т1ру№г в течение 5 мин с помощью ультразвукового гомогенизатора (тип US-300, производи- и продавае№1й Ниппон Сейки Сей- сакупо К.К., Япония). Каждую из полученных паст гелей вылив.чют в загрузочное устройство, котооое присоединено к форколонке с внутренним днаметрбм 7,5 мм и длиной 100 мм, соединенной одним концом с основной колонкой из нержавеющей стали с внутренним диаметром 7,5 мм и длиной 250 мм, имеющей на другом конце первый концевой фиттинг, снабженный фильтром, как использовано в примере 1, форколонка и основная колонка заполнены водным 0,2 мол/л раствором суль- фата натрия. После герметизации загрузочного устройства пропускают водный 0,2 мол/л раствор сульфата натрия (жидкости для заполнения) через загрузочное устройство и форколонку и основную колонку при скорости потока 0,5 rii/MHH (ЛС 0,68 м/ч) в течение 60 мин с помощью насоса. В течение этого времени паста геля движется в основную колонку, в то время как водный 0,2 мол/л раствор сульфата натрия выгружается, увлекая пасту геля, этот раствор используется в качестве жидкости для заполнения, через перв ый концевой фиттинг на нижнем конце основной колонки, образуя таким образом слой геля в основной колонке. После этого пос Еепенно увелк чивают скорость потока водного 0,2 мол/л раствора сульфата натрия при средней скорости увеличения давления 5 кг/см /ч в слое геля и при максимальной скорости увеличения давления 5 кг/см мин в слое геля до тех пор, пока манометр, упомянутый в примере 1, не покажет 26, 46 или . 57 кг/см. Поддерживая указанное достигнутое давление, продолжают пропускать жидкость для заполнения через колонку в течение еще 2 ч. После это- го отсоединяют загрузочное устройство и форколонку, а второй концевой 4иттинг присоединяют к каждой колонке для фиксации слоя геля.

Заполненные колонки испытывают в отнрщении и характеристических свойств, и практического применения с получением благоприятных результатов. Характеристические свойства предлагае- MiK колонок представлены в таблице.

, Ю 15 20 25 30 35 40

5 Q

5

Все эти колонки имеют исключительный предел молекулярного веса (считая на декстран) около 30000.

На колонке 1 разделяют смесь коммерческих у-глобулина, альбумина из сыворотки бычьей крови, альбумина из яичного белка и миоглобина, элюируют водным раствором с рН 7,0 0,3 мол/л хлористого натрия и 0,1 мол/л фосфата натрия. Каждьй компонент выделен примерно на 100%. Все эти протеины вымываются в порядке молекулярных весов.

На колонке 2 разделяют 100 мл (1 мг) водного 1 мас.% этиленгли- коля, элюируют дистиллированной водой при и при скорости потока 1,0 мл/мин. Из полученной хромато- граммы определяют ЭВТТ. Эту процедуру повторяют 800 раз. Величины ЭВТТ находятся в интервале 24,5-25,6 мм. Стабильность величины ЭВТТ может рассматриваться как демонстрация продолжительного срока службы колонки и отсутствие какого-либо разрушения ее.

Через колонку 3 непрерывно пропускают водный 0,2 мол/л раствор сульфата натрия со скоростью 1,2 мл/мин в течение 240 ч, после чего определяют величину ЭВТТ, чтобы показать -благоприятное значение 32,9 мм (ЭВТТ/Др 3,36). Не наблюдается разрушение колонки.

И р и м е р 3. Разделяют человеческую сыворотку на соединенных колонках 1 и 2, которые были приготовлены в соответствии с примером 2, элюируют при рН 7,0 водным раствором 0,3 мол/л хлористого натрия и О, 1 мол/л фосфата натрия при скорости потока 1,0 мл/мин, используя в качестве детектора ультрафиолетовый спектрофотометр при 250 нм (длина волны). На фиг. 3 показана хромато- грамма нормальной человеческой сыворотки, полученная в соответствии с приведенной процедурой, а на фиг. 4 показана хроматограмма сыворотки при почечной недостаточности. На одной и той же диаграмме две хро- матограммы, которые были получены при различной чувствительности детектора, приведе.ны для совместного показа основного и минимального компонентов сыворотки. Из этих хромато- грамм можно сделать вывод, что жидкостная хроматоррафическая колонка

9 14

согласно предлагаемому изобретению обладает отличной разрешаюп(ей способностью на вещества и что она особенно полезна для фракционирования смесей, содержащих много типов растворенных веществ, таких как кровь.

П р и м е р 4. Загружают в колбу смесь 100 г винилацетата, 41,4 г три- агшилизоцианурата, 70 г н-бутилаце- тата и 3,3 г 2,2 -азобисизобутиро- нитрила, проводят суспензионную полимеризацию, перезтерификацию и классификацию по методике примера 2, получают гель, имеющий величину Др 9,4 мм. Гель имеет концентрацию гидр- оксильных групп 7,1 мэк/г и величину W,1,20 мл/г. От этого геля отвешивают 13 г и заполняют ими колонку из нержавеющей стали с внутренним диаметром 7,5 мм и длиной 500 мм по методике примера 1, получают заполненную колонку, которая имеет величину ЭВТТ/Д. 2,75 и величину V,-/У„ 1,55.

Проводят хроматографию на этой колонке сыворотки пациента, страдающего почечной недостаточностью, по методике примера 2.с тем исключением, что анализ проводят с большей скоростью потока элюента. На фиг. 5 показаны хроматограмма, полученная при скорости потока элюента-1,0 мл/мин и хроматограмма, полученная при скорости потока элюента 2,0 мл/мин. Хромато грамма, полученная при такой высокой скорости потока элюента, как 2,0 мл/мин, что соответствует ,2,72 м/ч в величинах ЛС, четко по- - казывает такое же высокое разрешение как и на фиг. 5, т.е. на хроматограм ме, полученной при скорости потока элюента 1,0.мл/мин. Следовательно, колонка, заполненная в соответствии с предпагаемзш изобретением, обеспечивает высокоскоростную хроматографию с высоким разрешением. Кроме того, даже после использования для хроматографии 150 образцов сыворотки крови при скорости потока 2,0 мл/мин колонка сохраняет исходное разреше- кие и эффективность, которые она показывала при ее приготовлении. Это доказывает длительность срока службы колонок, заполненных в соответствии с предлагаемым изобретением.

П р и м е р 5. Проводят суспензионную полимеризацию смеси 100 г винилацетата, 32,2 г триаллилизоциану8 10

рата (степень сшивки 0,25), 40 г и- бутилацетата и 3,3 г 2,2 -азобисизо- бутиронитрила, фильтруют, экстрагируют, переэтерифицирутот и классифицируют по методике примера 2, получают гель, имеющий пелпчину Д 13 мм, Др/Др 1,32, концентрацию гидроксиль- ных групп 8,2 мэк/г и величину W

1,05 мл/г. Заполняют полученным таким образом гелем колонку с внутренним диаметром 7,5 мм и длиной 500 мм по методике примера 1, получают заполненную колонку с ЭБТТ/Д. 3,4 и

, . Проводят хроматографию на этой заполненной колонке водной смеси хлоридов N,N -диметил-4,4 -би- . пиридипия (NQ), Н-метил-4-(4-пири- дил)-пиридиния (MQ) И 4-метилпиридиния (MS), эту смесь получают во время приготовления сельскохозяйственного химиката, элюируют водным 0,3 мол/л хлористым натрием при скорости потока 1,0 мл/мин. Полученная

хроматограмма приведена на фиг. 6, где четко показаны фракции смеси. Из этого можно сделать вывод, что колонка, заполненная в соответствии с предлагаем 1м изобретением, также

эффективно применима для фракционирования и идентификации электролитов с низким молекулярным весом.

Формула изобретения

1. Колонка для жидкостной хроматографии, содержащая цилиндрический корпус и слой полностью пористого гидрофильного геля, в состав которо- го входят фрагменты винилового спирта.

отлич ающая ся тем.

что, с целью повышения скорости хромат о графиро в ания, разрешающей способности колонки и обеспечения прямого

анализа сыворотки и других компонентов крови, гель имеет средневесовой диа метр гранул 4-20 мм, величину влагоудерживания 0,6-2,0 мл/г и кон- центрацию гидроксильных групп 315 мак/г, а гельньш слой имеет степень однородности 2,0-4,0, определяемую через отношение эквивалентной высоты теоретической тарелки колонки к средневесовому диаметру гранул, и

упаковочное отношение 0/66-0,78, определяемое по формуле

где V - объем воды с наружной стороны гранул; Vj. - общий объем колонки.

2.Колонка по п. 1, отличающаяся тем, что гель выполнен из винипкарбоксилатного гомополимера или сополимера.

3.Колонка по п. 2, отличающаяся тем, что сополимер является сополимером винипкарбоксилата а сшивающий мономерi содержит изо- циануратные кольца.

А, Колонка по п. 2, отличающаяся тем, что сополимером является сополимер винилкарбоксилата а сшивающий мономер содержит циану- ратное кольцо,

5.Колонка по п. 3, отличающаяся тем, что сшивающий мономер, содержащий изоциануратное кольцо, является триаллилизоциану- ;ратом.

6.Колонка по п. 2, отличающаяся тем, что винилкарбокси- латный гомополимер или сополимер выполнен из мономера, содержащего по крайней мере две сложно-эфирные груп гы винилкарбоксилата.

7.Колонка по п. 6, отличающая с я тем, что мономером, содержащим по крайней мере две сложно0

5

эфнршче группы винилкарбоксилата, является дивиниладипат.

8.Колонка по пп. 1-7, о т л и- чающаяся тем, что она имеет диаметр 4-50 мм и длину 100-600 мм.

9.Способ заполнения колонки для жидкостной хроматографии, включающий приготовление гельной суспензии в растворителе, содержащей 1,1-4,0 кратное количество геля, которое необходимо для заполнения колонки, подачу гельной суспензии в загрузочную аппаратуру с последующей ее герметизацией, соединение аппаратуры с колонкой, на концах которой установлены фитинги с фильтрами, пропускание потока жидкости через загрузочную аппаратуру и нижний фильтр колонки для продвижения суспензии, изменение скорости потока жидкости для .регулирования упаковочного отношения, отсоединение колонки от загрузочной аппаратуры и фиксацию, гельного слоя фитингом с

5 фильтром на верхнем конце колонки, отлич ающий ся тем, что поток жидкости в объеме 1-300 внутренних объемов колонки пропускают с постоянной скоростью 0,2-1,5 м/ч, после чего увеличивают скорость потока с обеспечением среднего увеличения давления 2-80 кг/см /ч и максимального увеличения давления до 60 кг/см / /мин.

0

0

Изобретение относится к аналитическому приборостроению и может быть использовано в химической, медицинской, биологической и других отраслях промышленности для анализа сложных смесей веществ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Цель изобретения - повышение скорости хроматографирования, разрешающей способности колонки и обеспечение прямого анализа сыворотки и других компонентов крови. Колонка заполнена полностью пористым гидрофильным гелем, в состав которого входят фрагменты винилового спирта. Гель имеет средневесовой диаметр гранул от 4 до 20 мкм, величину влагоудерживания от 0,6 до 2,0 мл/г и концентрацию гидроксильных групп от 3 до 15 мэкв/г. Гельный слой имеет степень однородности от 2,0 до 4,0 определяемую через отношение ВЭП к средневесовому диаметру гранул и упаковочное отношение от 0,66 до 0,78, определяемое по формуле 1 - VOVT,где VO означает объем воды с наружной стороны гранул,VT -общий объем колонки. Колонку заполняют путем продвижения гельной суспензии потоком жидкости. Поток жидкости в объеме от 1 до 300 внутренних объемов колонки с постоянной скоростью 0,2-1,5 м/ч. Затем скорость потока увеличивают с обеспечением среднего увеличения давления от 2 до 80 кг/см²/ ч и максимального давления до 60 кг/см²/мин. 6 ил.

Ve

Фиг.1

Ve

фиг. 2.

Фиг.З

Фиг.

Фи1.5