Насадка для жидкостной хроматографии Советский патент 1987 года по МПК G01N30/48 C08L29/04 

Изобретение относится к методам хроматографического анализа, в частности к насадке для жидкостной хроматографии (ЖХ), и может быть использовано в области биохимии и медицины для высокоскоростного и высокоэффективного разделения или анализа веществ, растворенных в растворителе, в соответствии с механизмом разделения гельпроникающей хроматографии (ГПХ).

Цель изобретения - обеспечение пригодности насадки для высокоскоростного разделения и анализа веществ

Предлагаемый гель получают омылением сшитых сополимеров винилацетата (БА) или винилпропионата (ВП) с три- аллилизоциануратом (ТАЩ). Отношение

а

-г - У-характеризует степень омыа + D

ления сополимера (т.е. количество педроксильных групп) и гидрофиль- ность геля.

Коэффициенты ы и b рассчитываются по плотности гидроксильных групп (qOH) в геле и количеству звеньев ТАЩ, qOH обозначает эквивалент звеньев ВС на весовую единицу геля и может быть определено путем реагирования геля с уксусным ангидридом в пиридиновом растворителе,, при зтом измеряется количество израсходованного уксусного ангидрида в реакции с гидроксильными группами или изменение веса геля и рассчитывается концентрация гидроксильных групп по это измеренной величине. Например, 1 ммол уксусного ангидрида израсходован в реакции с 1 г сухого геля, qOH этого геля - 1 миллиэквивалент/г.

Количетсво ТАЩ определяется по содержанию азота, полученного с помощью элементарного анализа геля. Другими словами, q можно получить по qOH, а b - по величине, полученной путем вычитания общего количества звеньев ВС и ТАИЦ из общего количества звеньев в сополимере соответственно.

3с

а

ризует степень сшивки сополимера. Коэффициенты q и b определяются по указанному мтеоду, а с - по значениям элементарного анализа геля или путем расчета по молям ВА и ТАЩ, которые поставляются вместе (а + Ь) ис , в указанной формуле.

Отношение

X характе

5

0

5

Когда X находится в указанном диапазоне, гель с частицами небольшого размера имеет достаточную прочность для выдерживания высокого давления и высокой скорости. Такой гель также обладает достаточной гидрофильностью и плохо адсорбирует компоненты в вод- -ном растворе, в частности протеины и аминокислоты, что повьш1ает целесообразность его использования в высокоскоростной ГПХ.

Количественный состав насадки (100 вес.ч. сополимера и 100-198 вес.ч. йоды) характеризует степень набухания геля - Wg, которая соответственно находится в пределах 1,0-1,98 г воды/г сухого геля.

. Wn определяется следующим образом.

Гель, погруженный в воду и полностью в уравновешенном состоянии, центрифугируется для удаления воды, прилипшей к поверхности геля, и измеряется его вес (W). Гель просушит- вается и определяется его сухой вес Wg рассчитьшается по формуле

Wi - W2

(wp.

W,

w.

5

0

5

0

5

Предлагаемый гель характеризуется максимальным размером пор в частицах геля, соответствующим молекулярному весу полиэтиленгликоля или декстрана, равному 1,9-10 - 1,0-10, при кото- ром молекулы этих полимеров не проникают в поры частиц геля.

Вещества с молекулярным весом ниже критической величины могут разделяться с помощью ГПХ, а вещества с более высоким молекулярным весом по сравнению с критической величиной не могут проникнуть в поры геля, а проходят непосредственно через зазоры в геле. Следовательно, эти вещества дают тот же объем элиирования, несмотря на молекулярный вес, и, следовательно, не могут разделяться с помощью ГПХ

Mj,- может определяться по калибровочной кривой ГПХ, которая может быть получена путем построения графика логарифмов молекулярных весов отдельньк образцов, молекулярный вес которых складывается на ординате, а объем элюирования каящого образца - на абсциссе относительно набитой гелем колонне.

График на фиг.1 показьтает зависимость между объемом элюирования

3. 1311631

(V) в миллилитрах и молекулярным весом материала, предназначенного для разделения. Наклонная линия и линия, параллельная ординате, на этом графике представляют собой по существу прямые линии. Часть, на которой две линии пересекаются, называется кривой. Мр. выражается в виде величины

t1 rn

на ординате в точке, в которой про.имеющую мелкие поры, равномерно распределенные во внутренних частях частиц. Органические синтетические полимеры, имеющие сшитую структуру, разбухают в растворителе, имеющем сродство с зтими полимерами, и дают усадку при сушке. При использовании мягкого геля поры, заполненные растворителем при разбухании, поддерживаются

должение наклонной прямой линии пере- О только сшитой сеткой. Такая стека не

секает продолжение линии, параллельной ординате. М. представляет одно свойство, которое присуще гелю, и показывает исключительный молекулярный вес, при котором гель может оказывать разделяющее действие на основе различия размеров молекул. Вещества, имеющие больший молекулярньй вес по сравнению с исклк1чительным молекулярным весом, элюируются по существу вместе без разделения.

Мп.. определяется путем использо-

качестве эталона веществ, имеющих известный молекулярньй вес,- полиэтиленгликолей или декстранов, и дистиллированной воды в качестве ; растворителя. Поскольку поставляемые промьшшенностью водорастворимые стандартные полимеры имеют молекулярный вес меньше примерно 2000000, полную калибровочную, кривую нельзя получить по гелю, имеющему Мд,- , превьш1ающему 2000000. Поэтому Mg,- такого геля точно не определяется, а оценивается

15

вания в

20

25

30

поддерживается в разбухшем состояни и, следовательно, гель дает усадку большая часть пор исчезает. В этом случае удельная площадь поверхности становится по существу величиной на ружной поверхности частиц и имеет в общем очень низкую величину - менее 1 . При использовании твердого геля с твердой по1 истой структурой после сушки геля поры могут поддерживать по существу то же состояние, что в момент разбухания, хотя они дают незначительную усадку (т.е. поры имеют постоянный характер .Следова тельн5,твердьй гель имеет удельную площадь поверхности,которая намного больше по сравнению с мягким гелем.

Обычно предлагаемый гель удельную площадь поверхности (S) при мерно 5-1000 . Если гель имеет удельную площадь поверхности меньше нижнего предела диапазона, это означает, что гель имеет структуру однородного типа (мягкий гель), которая

по точке пересечения, в которой про- вряд ли содержит мелкие поры ипоэтому должение калибровочной кривой, опре- -не пригодна для высокоскоростной ГПХ.

деленное по молекулярным весам менее 2000000, пересекает продолжение линии, параллельной ординате, которая определяется при тех же условиях по гелю, имеющему меньший Мр,-,„.

Для того, чтобы гель имел механическую прочность, пригодную для высокоскоростной ГПХ, в сочетании с отсутствием адсорбционной способности, степень сшивки X предпочтительно должна быть в диапазоне примерно 0,25-0,32, когда М д, находится в диапазоне примерно 10 - 10 , и степень сшивки предпочтительно должна составлять примерно 0,27-0,35, когда Мр,- находится в диапазоне примерно 10 - 10.

Предлагаемый гель является полностью пористым твердым гелем, имеет большую удельную площадь поверхности в сухом состоянии. Полностью пористая структура означает структуру.

имеющую мелкие поры, равномерно распределенные во внутренних частях частиц. Органические синтетические полимеры, имеющие сшитую структуру, разбухают в растворителе, имеющем сродство с зтими полимерами, и дают усадку при сушке. При использовании мягкого геля поры, заполненные растворителем при разбухании, поддерживаются

5

0

5

0

поддерживается в разбухшем состоянии и, следовательно, гель дает усадку и большая часть пор исчезает. В этом случае удельная площадь поверхности становится по существу величиной наружной поверхности частиц и имеет в общем очень низкую величину - менее 1 . При использовании твердого геля с твердой по1 истой структурой после сушки геля поры могут поддерживать по существу то же состояние, что в момент разбухания, хотя они дают незначительную усадку (т.е. по . ры имеют постоянный характер .Следова- тельн5,твердьй гель имеет удельную площадь поверхности,которая намного больше по сравнению с мягким гелем.

Обычно предлагаемый гель , удельную площадь поверхности (S) при- мерно 5-1000 . Если гель имеет удельную площадь поверхности меньше нижнего предела диапазона, это означает, что гель имеет структуру одно;- родного типа (мягкий гель), которая

Удельная площадь поверхности определяется по способу BET с использованием газообразного азота.

Предлагаемьш гель обычно имеет средневесовой диаметр части (D) примерно 4-198 мкм. В частности, наиболее благоприятные характеристики для ЖХ гель имеет тогда, когда D,, имеет небольшое значение, например в диапазоне примерно 5-20 мкм. Когда требуется высокая разделяющая способность, Б геля должна быть в диапазоне примерно 5-12 мкм. D измеряется с помощью счетчика Коултера и рассчитывается по формуле.

55

DW

.5(;df) IKnj-dt )

где d,- - диаметр частиц; п- - частота частиц d,-.

с диаметром

5131

В жидкостной хроматографии разделяющая способность может быть повышена за счет уменьшения размера частиц набивки. Однако при пропускании растворителя через колонну, набитую гелем с частицами меньшего размера, значительно возрастают потери давления по сравнению с гелем, имеющим большие размеры частиц. Следовательно, при небольшой механической прочности геля гель деформируется или разрушается, вызывая ненормально большие потери давления, что делает невозможным СЖХ при использовании геля с малыми размерами частиц. Так как механическая прочность предлагаемого геля может быть значительно улучшена за счет регулирования различных свойств, включая число o ЯJmeния и степень сшивания, гель может вьдержи- вать высокие скорости и давления, несмотря на маленький размер частиц.

Размер пор предлагаемого геля может регулироваться в широком диапазоне, поэтому гель может применяться не только для разделения или анализа водорастворимых полимеров сахари- дов или протеинов, а также для анализа компонентов с молекулярной массой в несколько сот тысяч и миллионов, которые присутствуют в крови и моче, которые тесно взаимосвязаны с болез

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10

5

0

5

0

нями почек или печени или симптомами, например карцином. Поскольку предлагаемый гель обладает такими же высокими характеристиками, как гель для высокоскоростной ГПХ, эти анализы могут, выполняться в течение короткого периода времени с получением большего количества информации.

Предпагаемьй гель используется в виде насадки колонны. Используемая колонна обычно представляет собой цилиндр, изготовленный из нержавею- щей стали, но в зависимости от назначения может быть выбрана любая другая колонна

Примеры 1-19. Гели сшитого сополимера ВС с ВА и ТАИЦ (А) или ВС с ВП и ТАИЦ (В) помещают в качестве набивки в колонну из нержаве- кяцей стали даиметром 7,5 мм и длиной 50 см.

Характеристические показатели применяемых гелей (X, Y, Dy, W, S . и Мр.) определяют по описанным методикам. Определение Мр,- проводится на водном растворе декстранов и поли- зтиленгликолей с использованием детектора дифференционного рефрактора 111одекскК1, модель S Е-11, насоса и инжектора модели 635А.

Показатели применяемых г елей сведены в таблицу.,

З-Ю

1,9-10

3

8-10

2.JO

5-10

5-10

2-10

1 -10

1-10

2-W

Мп. определяется по полиэтйленгликолю, декстрану.

На колонне с насадкой согласно примеру 1 проводился анализ v-глобулина, алюбумина бычьей сыворотки, овалюбумина и миоглобулина с использованием в качестве ного раствора, рида натрия и 0,1 М фосфата, натрия, а также детектора ультрафиолетового спектра поглощения. Протеины элюиро- вались по порядку, при этом выход протеина с большим молекулярным весом составил по существу 100%. Измерение всех образцов проводилось при скорости потока 1 мп/мин

Кроме того, анализировали раствор образца сублимированной человеческой сьшоротки, получаемая хроматограмма представлена на фиг.2, на которой пик А в основном показыв ает алюбумнн пик В - креатинин и пик С - мочевую кислоту. Некоторые компоненты быпи элюированы в большем количестве по сравнению со свободным объемом колонны в связи со слабой абсорбционной способностью геля, но ряд компонентов был обнаружен и выделен после элюирования-j--глобулина и алюбумина.

На колонке с насадкой согласно примеру 2 проводили анализ образца

растворителя вод содержащего 0,3 М хло

Продолжение таблицы

в остальных примерах - по

0

5

0

5

сублимированной человеческой сыво- I роткн. Полученная хроматограмг а представлена на фиг.З, где пик D показывает в основном алюбумин, пик Е - креагинин, а пик F - мочевую кислоту, Число пиков меньше по сравнению с фиг.2 вследствие низкой чувствительности измерений. Основная картина кривой элюирования такая же, как на фиг.2. Следовательно, с помощью геля этого примера можно обнаружить и отделить ряд компонентов.

На колонке с насадкой согласно примеру 5 проводят анализ стандартных образцов алюбумина бычьей сыворотки, овалюбумина и миоглобулина. Полученная хроматограмма представлена на фиг.4, где кривая G показывает кривую элюирования алюбумина, кривая И - кривую элюирования овалюбумина и кривая I - кривую элюирования миоглобулина.

Результаты показывают, что гель этого примера очень эффективен для отделения протеинов. Измерения на всех образцах проводились при скорости потока 1 мл/мин, каждый анализ проводился в течение 20 мин.

9131

На колонке с насадками согласно примерам 3-4, 6-14 также проводили анализ протеинов, включая j -глобулин, яичный альбумин, овалюбумин и миогло- булин. Анализ проводился при скорое- ти потока 0,5-2 мп(мин в течение 10-20 мин. Полученные хроматограммы показывают элюирование белков в порядке возрастания- молекулярных весов, степень извлечения белков 90-100%.

На колонке с гелями согласно сравнительным примерам 15-19 проводили анализ - -глобулина и альбумина бычьей сьшоротки, овалюбумина и миоглобули- на. Однако вследствие недостаточной прочности геля и больших потерь давления в колонке и почти полной абсорбции на геле белков пики элюиро- вания на хроматограммак не бьши обнаружены.

Как следует из примеров, предлагаемая насадка обеспечивает высоко- скоростно е разделение и анализ веществ методом гельпроникающей жидкостной хроматографии

Формула изобретения

Насадка для жидкостной хроматографии на основе водного геля сшитого гидроксилсодержащего сополимера, отличающаяся тем, что,.с целью обеспечения пригодности насадки для высокоскоростного разделения

5

0

5

10

и анализа веществ, она содержит в качестве сшитого гидроксилсодержаще- го сополимера сополимер винилового спирта с винилацетатом или винилпро- пионатом и триаллилизодиануратом при молярном отношении звеньев а/а + b 0,4-0,8 и Зс/а + b + 3с 0,25-0,4, где а, b и с - молярные отношения соответственно звеньев винилового спирта, виниладетата и винилпропионата и триаллилизоцианурата к общему числу звеньев в сополимере, при среднем диаметре частиц геля 4-198 мкм и максимальном диаметре пор в них, соответствующем молекулярной массе поли- этиленгликоля или декстрана, равной 1,9-10 - 1,0-10, при котором молекулы этих полимеров не проникают в поры частиц геля, при следующем соотношении компонентов, мае,ч.: Сшитьп сополимер ТОО Вода100-198

Приоритет по признакам.:

25.06,80 - применение для наладки водного геля сшитого сополимера с определенным по формуле размером частиц, диаметром пор и содержанием воды;

26,12.80 применение для насадки водного геля сшитого сополимера с определенным по формуле молярным отношением звеньев сомономеров;

МНт

1дМ

Изобретение относится к насадкам для жидкостной хроматографии. Насадка позволяет проводить высокоскоростное разделение и анализ веществ, обеспечивает разделение смеси белков при скорости потока 0,5-2 мл/мин в течение 10-20 мин (степень извлече-. кия белков 90-100%). Насадка представляет собой водный гель сшитого сополимера винилового спирта (ВО), винилацетата (ВА) или винилпропиона- та (ВП) и триаллилизоцианурата (ТАИЦ) при молярном соотношении звеньев а/а+ + b 0,4-0,8 и 3 с/а + b + 3 с 0,25-0,4, где а, b и с - молярные отношения соответственно звеньев ВС, ВА или ВП и ТАЩ к общему числу звеньев в сополимере, при среднем диаметре частиц геля 4-198 мкм, максимальном диаметре пор в них, соответствующем молекулярной массе полизти- ленгЛиколя или декстрана, равной 1,910 - 1,010, при котором молекулы этих полимеров не проникают в поры частиц геля, и содержании воды в геле 100-198 мае.ч. на 100 мае.ч. сшитого сополимера. 1 табл. О) оэ со см

gjuff.l

V

ю

а

30мин

L.

яг

7

т- 8

Редактор М.Петрова

Составитель Б.Филимонов

Техред, Л.Олейник Корректор А.Ильин

Заказ, 1907/58Тираж 777Подписное

ВНИШШ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

72

10 // фиа

73 Л