Изобретение относится к белковой инженерии, в частности к стабилизации фактора некроза опухоли,полученного генно-инженерным путем..
Способ стабилизации физиологически активного соединения включает прибавление альбумина к водному раствору или содержащему фактор некроза опухоли (ФНО), где указанное физиологически активное соединение получено с использованием рекомбинантной ДНК кодирующей фактор некроза опухоли, обладающий цитотоксическим действием на клетки L-M и способный вызывать
геморрагический некроз трансплантированной мышам 3ALB/C саркомы Meth A.
Фактор некроза опухоли получают обычным методом рекОмбинантных ДНК
с использованием рекомбинантной ДНК, кодирующей физиологически активное соединение. При испытании ФНО прояв - ляет цитотоксическую активность против клеток L-M и вызывает геморрагический некроз трансплантированной мышам BALB/C саркомы MethA, ФНО характеризуется следующей последовательностью аминокислот.
W
O5 О
O5
Изобретение относится к белковой инженерии, в частности к стабилизации фактора некроза опухоли,полученного генно-инженерным путем. Способ стабилизации физиологически активного соединения включает прибавление альбумина к водному раствору фактора некроза опухоли, который получают в результате культивирования штамма ESCHERICHIA COLI, трансформированного рекомбинантной плазмидной ДНК PHTNF LAC UV 5-2 с последующим культивированием и выделением конечного продукта. 6 табл.
Ser Ser Ser Arg Tlir Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asa Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Agr Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu He Tyr Ser Gin Val
Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr
O4
31607690 4
His Thr He Ser Arg lie Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala He Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro He Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu lie Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly He He Ala Leu a фрагмент ДНК, кодирующий M10, име- ет следующую структуру:
ТСА ТСТ ТСТ CGA АСС CCG AGT GAC AAG CGT GTA GCg CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG GAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GGC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC АТС TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC АТС AGC CGC АТС GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC АТС AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC АТС TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG АТС AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG АТС ATT GCC CTG,
Данньй полипептнд получают следую- Л/человек отбирают для гибридизации
щим образом.с помощью 32 Р-меченной к-ДИК кроТкань поджелудочной железы челове-личьего ФНО.
ка или кролика измельчают до вымрро- 3. Из соответствующих кйонов выдеженного порошка, депротекнизирую4,ляют ДНК, составляют ее рестрикционв результате осазвдения получают вы-ную карту и анализируют гибридизасокомолекулярную кроличью или челове- 45Дией по Sautheres,
ческую ДНК; высокомолекулярную ДНК Полученные в результате гидролиза
частично расщепляют; фрагменты ДНКрестриктазой фрагменты, содержащие
фракционируют по размерам и вьщеляютгены кроличьего или человеческого
фрагмент размером 15000-20000 парФНО, субклонируют в плазмйдные вектооснований (по); фрагменты,получен- ры и затем определяют в них последоные на предьщущей стадии, клонируютвательность оснований, с использованием вектора фага Т А. Последовательность оснований
Charon 4А; получают библиотеку ДНКв к-ДНК кроличьего ФНО сравнивают
человека или кролика в фаге.с последовательностью оснований в ге1.В к-ДНК кроличьего ФНО вводятне кроличьего ФНО и определяют экзо- радиоактивную метку 32 по способу и интроны в гене кроличьего ФЧО. трансляции.5. После этого последовательность
нований гена кроличьего ФИО и определяют экзоны и интроны гена человеческого ФИО.
Полученный таким образом трансфор мированньй организм культивируют в щироких масштабах обычным способом с получением ФНО. После этого супер- натант культуры или клеточный экстракт собирают и получают ФНО.
Полученньм ФНО очищают с использованием либо с помощью обычных биохимических методик, с получением водного раствора ФНО, который лио
10
5
20
25
30
35
0
п
фильно высущивают и получают поро- щок очищенного ФИО.Очистку ФНО осуществляют путем высаливания с использованием сульфата аммония, ионообменной хроматографии с использованием анионообменной смолы, гель-фильтрации и электрофореза.
Альбумин прибавляют к раствору в количестве приблизительно 1 мкг или больше, предпочтительно 10 мкг или больше, особенно предпочтительно 100 мкг или больше, на 1 мл раствора, имеющего цитотоксическую активность по отношению к клеткам L-M, равную 10 -10 ед./мл (единица активности будет определена ниже).Верхний предел количества альбут ина обычно определяют по его растворимости и вязкости результирующего раствора. Верхний предел количества альбумина как правило равен 50 или 10 мг на 1 мл раствора ФИО. Если ФИО стабилизируют в форме порошка, то альбумин прибавляют к порошку в таком количестве, чтобы водньш раствор, получаемый растворением порошкообразного физиологически активного соединения . и имеющий активность ед./мл, имел вышеуказанные концентрации альбумина.
Способ,.которым прибавляют альбумин, не играет существенной роли. Например, альбумин в порошкообразной форме можно непосредственно прибавлять к раствору активного соединения. Кроме того, порошкообразный альбумин для удобства может быть растворен в воде или подходящем буфере и прибавлен к раствору. Порошкообразный альбумин также может быть смешан с порошком активного соединения. Прибавление альбумина может быть осуществлено в любой момент стадии очистки или стадии получения фармацевтических рецептур.
ДНК из тимуса теленка/SS РЕ: 0,13 М NaCl + 10 мМ ЫаН,Р04. + Г мМ ЭДТУ, рН 7,4.
СХФ - среда хранения фага, содержащая 5,8 г NaCl, 2 г MgS04 7Нв.О, 50 мл 1 М трис-ИС (рН 7,5) и 5 мл 2%-ного раствора желатины на 1 л.
Ыг-Бульон: среда, содержащая 10 г 5 NZ-амина, 5 г ЫаС1 и 2 г MgS04 7Н О (NZ-амин представляет собой типа AM гидролизат казеина, пpoизвoди g Й и поставляемый Humko Sheffield Chemical Durnon of Kraft, Gnc., CFIA).
5
ИПТГ: изопропилтиогалактозид. х-гал: 5-дибром-4-хлор-3-индолил- гелактозид,
ТАЗ; 0,04 М Трис-ацетат (рН 8,0) 0,002 М ЭДТУ.
5 X раствор Денхардта: водный раствор, содержащий 1000 мг Ficoll, 1000 мг поливинилпирролидона и 1000 мг БСА в 1 л.
пара оснований.
Пример, Крольчихам массой 2,5-3 кг инъекцией в ушную вену вводят по 50 мг убитых формалином Рго- pionebacterium acnes (Corynebacteri- um parvura, Wellcome Research Laboratories Англия), Через 8 дней снова через ушную вену вводят 100 мкг эндотоксина (дипололисахарид из Esche- richia coli 026:В6, производство Difco Laboratories, QM, через 2 ч из сердца отбирают цельную кровь, К полученной крови прибавляют гепари- нат натрия в количестве 100 ед, на 100 мл. Затем кровь центрифугируют при охлаждении со скоростью 5000 об/ /мин в течение 30 мин для удаления клеток крови и нерастворимых твердых соединений, В результате из 40 кроликов получают плазму (2,4 л), имеющую дитотоксическую активность сывороточного ФИО, равную 3x10 ед,/мл,
К плазме (2,4 л) прибавляют 24 г цеолита, Результируюпую смесь перемешивают в течение 1 ч., после чего отфильтровывают, фильтрат смешивают с 1,2 л буфера 0,04 М Трис-НС1 (рН 7,8) и наносят на колонку с DEAE- Spharose CL-6B, тщательно уравновешенную против 0,04 М Трис-НС1 буфер (рН 7,3), содержащего О,1 М NaCl, Колонку промывают 0,04 М Трис-НС1 буфером и адсорбированньш ФИО элнЬиру ют 0,04 М Трис-НС1 буфером (рН 7,2), содержащим 0,18 М NaCl, Фракции,про- являющие цитотоксическую активность против L-клеток, концентрируют ульт- рафильтрацией, Полученньй таким образом концентрат наносят на колонку с Sephacryl S-200, тщательно уравновешенную против 5 мМ фосфатного бу- фера, и подвергают гель-фильтрации с использованием этого же 6yii)epa, Активные фракции концентрируют ультрафильтрацией и получают Очищенный ФИО, имеющий активность 3, ед, и удельную активность 18x10 ед,/мг,
Кроличий сывороточньм ФИО смешивают с полным стимулятором Фрейнда
0
г 5 о
Q 5
5
(1:1) и подкожно вводят в спину мышам-самцам Ва LB/C, имеющим возраст
2 недель. Вышеуказанную операцию повторяют через 2 и 4 недели после первоначальной инъекции. Через 1 неделю после последней инъекции отбирают цельную кровь. Из отобранной крови получают сыворотку.
Полученную таким образом сыворотку прибавляют к культуральной среде для оценки цитотоксической активности ФИО против L-клеток в таком количестве, чтобы результирующая концентрация соответствовала 500-кратному разбавлению, Цитотоксическую активность кроличьего сывороточного ФИО против L-клеток измеряют так, как описано выше. Устанавливают,что кроличий сывороточный ФИО не проявляет цитотоксической активности против L-клеток, Из этого результата можно сделать вывод о том, что полученная на этой стадии мьщ1иная сыворотка содержит антитело к кроличьему сывороточному ФИО (далее обозначают как анти-ФНО антитело),
Крольчихам внутривенной инъекцией вводят убитые формалином клетки Propionibacterium acnes (Corynebac- terium parvum, Wellcome Research Laboratories, Англия), Через 7 дней кроликов подвергают трехестомии,легкие промывают физиологическим солевым раствором и получают таким образом всплывающие клетки,, Пол ченные таким образом клетки промывают физиологическим солевым раствором, С использованием культуральной среды RPM1 1640, содержащей 10 об,% зародышевой телячьей сыворотки; клетки инкубируют при 37 °С в воздухе,содер- жащем 5% углекислого газа. Клеточную культуру разделяют на две группы и к одной из них прибавляют эндотоксин, полученньш из E,coli (ли- пополисахарид из E,coli 026:В6), в концентрации 10 мкг/мл, К другой группе прибавляют такое же количество дистиллированной воды, Суперна- тант клеточной культуры, к которой прибавлен эндотоксин, проявляет цитотоксическую активность против L- клеток, и активность достигает максимума в течение 7ч, Эта .активность подавляется анти-ФНО антителом, но не подавляется нормальной мьш1иной сывороткой,
Кроме того, супернатант клеточно культуры, к которой не прибавляли эндотоксин, не проявляет цитотоксич ности против L-клеток.
К клеточной культуре, к которой прибавлен эндотоксин, дополнительно прибавляют радиоактивный L-/35S)-Me тонин (1300 кюри/ммоль, в количестве 1 милликюри/мл). Супернантант анлизируют электрофорезом на полиак- риламидном геле с ДСН в соответствии со способом Laemmli. Концентрацию геля доводят до 12,5 мас.%. После электрофореза гель обрабатывают с помощью ENHANCE и после высушивания экспонируют на рентгеновскую пленку. Устанавливают, что в супер- натанте клеточной культуры в присутствии эндотоксина образуется соединение, имеющее молекулярньш вес около 17500.
Супернатант каждой клеточной культуры подвергают электрофорезу на по- лиакриламидном геле с ДСН так же, как описано выше. После этого гель встряхивают в 2,5%-ной W 40®в течение 1 ч и затем в воде в течение 2 ч. После встрахивания каждую полосу миграции отделяют вырезанием и режут на полоски шириной 2 мм в направлении, перпендикулярном направлению миграции. Каждую полоску культивируют с L-клетками и оценивают ци- тотоксическую активность по отношени к L-клеткам. В той полосе, где мик- рировали супернатант клеточной культуры, содержащей эндотоксин,цитоток- сическую активность против L-клеток обнаруживают в положении, соответствующем молекулярному весу 17500. В других положениях цитотоксичность не обнаруживают.
Неточную культуру инкубируют в . течение 2 ч после прибавления эндотоксина, после чего центрифугируют и собирают клетки. Экстракцию цито- плазматической РНК из собранных клеток, экстракцию м-РНК проводят из цитоплазматической РНК. К 3x10 кл. прибавляют 4 мл 4 М раствора гуани- динтиоцианата и смесь измельчают с помощью гомогенизатора. Остатки удаляют центрифугированием и растворяют в смеси 2,4 г хлорида цезия. Смесь осторожно вьшивают в полиалломерную пробирку, куда предварительно прибавляют 2,5 мл раствора, содержащего 5,7 М хлорид цезия и О,1 М ЭДТУ (рН
7,5), и затем подвергают ультрацентрифугированию при 30000 об/мин в течение 12 ч при . После прибавления супернатанта осадок растворяют в 1 мл 10 мМ буфера Трис-НС1, содержащего 5 мМ ЭдТУ и 1% мае./об.% ДСН. Результирующий раствор экстрагируют смесью хлороформ: 1-бутанол (4:1 по IQ объему). К водной фазе прибавляют 0,05 объема 2 М ацетата натрия и 2,5 объема этанола и оставляют стоять при 20 С в течение 2 ч или дольше, в результате чего РНК вьтадает 15 в осадок. Осадок собирают центрифугированием, сушат и растворяют в 500 мкл стерильной воды. В результате получают раствор цитоплазматической РНК. Полученный раствор РНК нагревают 20 при 63 С в течение 2 мин, а затем быстро охлаждают. К раствору прибавляют 500 мкл 1 О мМ буфера Трис-ЗДТУ двухкратной концентрации (рН 7,4), смесь наносят на 200 мг олиго-d-T- 5 целлюлозы, набитой в колонку, и промывают 10 мл того же самого буфера (единократной концентрации). Оставшееся в колонке соединение элюируют 2 мл элюирующего буфера, содержащего 0 О мМ Трис-НС1 буфер (рН 7,4), мМ ЭДТУ и 0,1 мае./об.% ДСН. К элюенту прибавляют 0,05 объема ацетата натрия и 2,5 объема этанола и смесь охлаждают при -20 с для образования осадка. Осадок собирают центрифугированием, наносят на колонку с олиго- d-Т-целлюлозой и собирают фракции, адсорбирующиеся на олиго-ё-Т-целлюло- зе. Выделяют 85 мкг м-РНК, как пока- д зывает анализ ультрафиолетового спектра.
330 мкг РНК растворяют 250 мл воды, и результирующий раствор слоем наносят на 10 мл 5-25%-ноге линейного сахарозного градиента плотности. Градиент плотности сахарозы получают с использованием Трис-буферных растворов, содержащих 25 мМ Трис-НС1 (рН 7,2), 2 мМ ЭДТУ, 1 мае./об.% ДСН и соответственно: 5 и 25% сахарозы.
5
0
55
Проводят ультрацентрифугирование пp 40000 об/мин в течение 12 ч при 4 С и отбирают фракции, каждая из которых имеет объем 400 мкл, с помощью аппарата выделения фракций, после чего проводят осаждение этанолом.Осажденные фракции центрифугируют и растворяют в стерильной воде.
11
Проводят трансляцию м-РНК с использованием осцитов Xenopus laevis Фракционированнзпо м-РНК растворяют 13 стерильной воде с получением концентрации 1 мкг/мкл и раствор вводя 13 социты в небольшом количестве (50 ил ид, клетку). Затем клетки культивируют 24 ч в растворе Барса (содержит 7,5 Трис-НС1, рН 7,6, 83 .мМ NaCl, 1 мМ КС1, 0,33 мМ нитрата кальция, 0,41 мМ хлорида кальция 0,82 мМ сульфата магния, 2,4 мМ бикарбоната натрия, 18 ед/мл пенициллина G и 18 мкг/мл стрептомицина), содержащем бычий сывороточный альбумин в концентрации I мг/мл. Осциты измельчают в культуральной среде с помощью стеклянной палочки. После этого культуральную жидкость центрифугируют и супернатант испытывают на цитотоксическую а ктивность проти L-клеток, м-РНК, транслируемая с получением полипептида, обладающего максимальной активностью, по данным седиментационного анализа имеет размер 16S. Активность подавляется ан- ти-ФНО антителом.
С использованием 5 мкг фракционированной м-РИК получают двунитиевую ДНК. Двунитиевую фракционируют по раз.мерам на 3,5%-ном полиакрил- амидном геле и получают 530 иг фракции, имеющей размер приблизительно 1000-2000 п.о. 7 нг этой фракции удлиняют дезокси-С-остатками с использованием концевой дезоксинукле- отидилтрансферазы, ренатурируют с пмощью 56 нг плазмиды рВе 322,которую расщепляют PstI, и удлиняют остатками лезокси-G. Ренатурированнук) таким образом смесь вводят в штамп E.coli К-12 (HBI01, АТСС 33694) для трансформации штамма, Б результате получают 12000 трансформированных организмов.
Кроличий ФИО подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле с д децилсульфатом Ыа для очистки. Част геля окращивается Кумасси бриллиантвым голубым. Полосу в месте,соответствующем молекулярному весу 17000 вырезают из геля и экстрагируют 1%-ным раствором бикарбоната аммони 3 виде белка выделяют приблизительно 130 мкг ФИО.
. 150 мкг выделенного ФИО растворяют в 75 мкг 1%-ного раствора бикар- (Зоната аммония, после чего прибавля
0
1 2 ТРСК.
ют 3 мкг трипсина ТРСК. Смесь инкубируют при в течение 4 ч. После этого смесь фракционируют с помощью
жидкостной хроматографии высокого давления на колонке и получают фрагменты, отщепленные трипсином.
ФИО высокой степени очистки и его отщепленные трипсином фрагменты обессоливают на колонке с Sephadex-25, после чего лиофильно высушивают. Очищенный ФИО и отщепленные трипсином фрагменты подвергают разложению по Эдману с N-окончания. Каждую отщепляемую аминокислоту на каждой стадии анализируют обычным способом с помощью хроматографа высокого давления, модель SP3100. В результате устанавливают, что ФИО имеет следующую N- концевую аминокислотную последовательность : Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu- Ser-Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-ValAla-Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Glu-Leu-Gln-,
Один из отщепленных трипсином фрагментов имеет Соледующую концевую аминокислотную последовательность:
Glu-Ths-Pro-Glu-Glu-Ala-Glu-Pro-MetAla.
Олигодезоксинуклёотиды, комплементарные к последовательности оснований м-РП К, рассчитанной из амйно- кислотной последовательности кроличьего ФИО, синтезируют в соответствии с усовершенствованным фосфотри- эфирным способом. При получении оли- годезоксинуклеотидов, 28 олигоде- зоксинуклеотидов, рассчитанных из аминокислотной последовательности
кроличьего ФИО, классифицируют по пяти группам, а именно группам 16, 16, 32, 32 и 32, и синтезируют в виде смесей олигодезоксинуклеотидов соответствующих групп, С полученных
олигодезоксинуклеотидов соответствующих групп снимают защиту обычным способом и их очищают колоночной хроматографией на Sephadex-50 электрофорезом на 20 мас.% полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину, и колоночной хроматографией с использованием Е52. Полученные таким образом Олигодезоксинуклёотиды соответствующих групп подвергают диализу
против буферного раствора 0,1 Трис-ЭДТУ,
В каждый из очищенных олигодезок- синуклеотидов соответствующих групп вводят радиоактивную метку с использеванием Т4-полинуклеотидкиназы и 32Р-аденозинтрифосфата по известной методике и затем очищают колоноч ной хроматографией с использованием DE52. Радиоактивное соединение вводят в каждый из нуклеотидов соответствующих групп в количестве приблил
зительно 3x10 имп/мин на 1 мкг.
м-РНК клеток, вырабатывающих ФИО, обрабатывают раствором, содержащим М глиоксаль, 10 мМ и 50 об.% диметилсульфоксида, при в течение 60 t-nm и затем фракционируют с использованием электрофореза на 1,1 мас.% агарозном геле. Фракционированную м-РНК переносят на фильтр злектрофоретического типа для получения отпечатков. После зтого м-РЧК на фильтр обрабатывают раствором 5 х раствор Денхардта, содержащим раствор 5 X SSC, 0,75 М NaCl + 0,075 5 цитрат натрия, -рН 7. 150 мкг/мл денатурированной лососевой сперматозо- идной ДНК, при в течение 2 ч и затем обрабатывают раствором 5 х р-р Денхардта, содержащим 1x10 имп/мин на I мл меченых олигодезоксинуклео- тидов, и раствором 5 х SSC, при в течение 2 ч. Полученный таким образом фильтр промывают раствором 6 X SSC (0,9 М Had + 0,09 М цитрат натрия), рН 7, четыре раза,последовательно при комнатной температуре, 40, 50 и . Устанавливают, что олигодезоксинуклеотиды, обозначенные как проба Ml, наиболее сильно гиб- рьщизуются с м-РНК, это указывает на то, что олигодезоксинуклеотид, имеющий последовательность оснований, полностью комплементарную.м-РНК,содержится в олигодезоксинуклеотидах, обозначенных как проба Ml. ДНК трансформированных организмов гибридизу- ют с меченым олигодезоксинуклеотидом (пробой Ml). Отбирают 49 колоний, сильно гибридизирующихся с мечеными олигодезоксинуклеотидами (проба Ml) и затем фиксируют на другом нитро- целлюлозном фильтре. После этого с использованием 49 колоний проводят дальнейшую гибридизацию и отбирают 9 колоний, наиболее сильно гибриди- зуемых мечеными олигодезоксинуклеотидами (пробой Ml).
Из 9-ти колоний получают приблизительно по 5 мкг плазмид. Каждую из полученных плазмид расщепляют с использованием рестрикционных фермен20
25
07690
тон PstI, TaqI, Rsal и PvuII. После этого фрагменты, полученные расщеплением с помощью соответствующих ре- с стрикционных ферментов, сравнивают с учетом их длины.
Результаты показывают, что все девять штаммов, соответствующих девяти колониям, имеют последователЬ- 0 ность оснований фрагмента, отщепляемого PvuII и Rsal и состоящего из приблизительно 50 п.о., и что большинство из 9 штаммов содержат последовательность оснований фрагмента, J5 отщепляемого Rsal и состоящего из приблизительно 200 п.о. Результаты свидетельствуют о том, что штаммов имеют частично одинаковую последовательность оснований.
Семь штаммов, содержащих плазми- ды, указанные в табл.1, отдельно культивируют в 2 мл LB-среды, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина, до тех пор, пока оптическая плотность растворов не достигнет значений, указанных в табл.1, после чего проводят центрифугирование и получают соответ- ;Ствующие штаммы. Каждый из получен- ных штаммов отдельно прибавляют к 30 2 мл физиологического солевого раствора и разрушают ультразвуком.Полученные растворы центрифугируют и оп- . ределяют цитотоксическую активность полученных супернатантов против L- j клеток. Результаты представлены в -табл.. в пустом опыте воспроизводят :вышеуказанную методику с использованием штамма, содержащего плазмиду pBR 322.
40Цитотоксическая активность против
L-клеток подавляется анти-ФНО антителом, но не подавляется нормальной мышиной сывороткой. Это указывает на то, что все девять вьш1еуказанных ко- 5 лоний имеют плазуиды, содержащие олигодезоксинуклеотиды, кодирующие ФИО. Штаммы E.coli, содержащие плазми- ды рВ 2-7 и pR 13, культивируют в 1 л среды М9, содержащей 10 мкг/мл 0 тетрациклина. Ппазмиды выделяют в количестве приблизительно 150 мкг.
Последовательность оснований вставки каждой плазмиды определяют по химической методике Максама-Гильберта. 5 Таким образом, выясняют полную последовательность кроличьего ФИО.
На этой стадии проводят конструирование плазмиды с использованием рекомбинантной плазмиды pR 12 с псшучением прямой экспрессии ФИО в 11 с использованием lac в качестве промотора. Первые 10 мкг плазмиды pR 12 расщепляют с помощью 10 ед. Ара I при в течение 2 ч и подвергают электрофорезу на 4 мас.% полиакрил амйдном геле, вьщеляя фрагменты длиной 610 п.о. Путем электро- элюирования из геля выделяют прибхш- зительно 1 мкг фрагментов.
Синтезируют два олигодезоксинук- леотида; З -GATCCATGTCAGCTTCTCGGGCC- З и 5 -CGAGAAG CTGACATG3 . После этого каждое 5 -окончание олигодезокси- нуклеотидов (приблизительна 100 пи- комоль) фосфорилируют с использованием Т -полинуклеотидкиназы. После завершения реакции реакционную смесь экстрагируют фенолом и затем хлоре- формом. Затем полученные синтетические олигомеры смешивают с 0,5 мкг Ара 1-фрагмента длиной 630 п.о, и дят высаживание этанолом. Фрагменты связывают с синтетическими олигомера ми при 4 °С в течение ночи с использованием 10 ед. Т4.-ЛНК-лигазы. После завершения реакции реакционную смесь осаждают этанолом и расщепляют 20 ед BamHI при 37 С в течение 3 ч, после чего проводят электрофорез на 4 мас. полиакриламидном геле и электроэлюи- рованием выделяют фрагменты длиной 670 ПсО, 1 мкг коммерчески доступной
плазмиды-риС-3 расщепляют с помощью
BamHI, экстрагируют фенолом, затем хлороформом, после чего осаждают этанолом и получают вектор. 0,5 мкг полученного вектора связывают с помощью Т -ДНК-лигазы с получением вьше фраг- ментом, имеющим сайты BamHI на обоих концах и содержащим приблизительно 670 пар оснований, кодирующих ФИО. E.coli Ml О трансформируют с использованием полученного выше вектора и культивируют на агаровой среде,содержащей 1 мМ ИПТГ и 0,004 (мае./об.) х-гал, с получением приблизительно 200 белых колоний. Из 100 этих трансформированных организмов получают плазмидную ДНК и расщепляют ее с помощью liamHI, В результате устанавливают, что 15 плазмид содержат, как и предполагалось, BamHI-фрагмент (около 670 п.о.). Для проверки направле- ния инсерции 15 вьоаеуказанных плазмид расщепляют Есо RI, имеющей литпь один сайт узнавания в pUC-8 и РТОИ, имеющий лишь один сайт узнавания в
0 5 0
5
о 5 Q
фрагменте длиной приблизительно 670 пар оснований, и подвергают электрофорезу на 6 мас.% полиакриламидном геле. В результате устанавливают,что 7 плазмид имеют, как и предполагалось, фрагмент, состоящий из приблизительно 140 п.о., и что направление транскрипции промотора lac на pUC-8 согласуется с направлением транскрипции олигодезоксинуклеотидов, кодирующих ФИО.
Анализ последовательности ДНК показывают, что 7 плазмид имеют одинаковые последовательности и содержат нужную нуклеотидную последовательность в переходах между lac-промотором, синтетической ДНК и к-ДНК.
Конструирование других плазмид проводят с использованием рекомби- нантной плазмиды pR 17 с получением прямой экспрессии ФИО в E.coli с использованием lacUV 5 в качестве промотора. Сначала 10 мкг плазмиды pR 17 расщепляют 10 ед. Apal при 37 С в течение 2 ч, подвергают электрофорезу на 4 мас.% полиакриламидном геле и выделяют фрагменты, содержащие приблизительно 630 . Примерно 1 мкг фрагментов вьщеляют из геля электроэлюированием. Синтезируют два олигодезоксинуклеотида: 5- AATTCATGTCAGCTTCTCGGGCC-З и CGAGAAGGTGACATG-3 . После этого каждое из 5 -окончаний этих двух олигодезоксинуклеотидов (приблизительно 100 пикомоль) фосфорилируют с исполь- зрванием Т -полинуклеотидкиназы. Пос- ле завершения реакции реакционную смесь экстрагируют фенолом, а затем хлороформом. Далее синтетические олигомеры смешивают с 0,5 мкг предварительно полученного .из плазмиды pR 1 7 и осажденного этанолом Apal-фрагмен- та (приблизительно 630 п.о.). Фрагмент связывают с синтетическими оли- гомерами при в течение ночи с использованием 10 ед. Т -лигазы.После завершения реакции реакционную смесь осаждают этанолом, расщепляют 20 ед. EcoRI при 37 С в течение 3 ч и затем проводят электрофорез на 4 мас.% полиакриламидном геле и электроэлюированием вьщеляют фрагмент (приблизительно 670 п,о.).
1 мкг рОР95-15 расщепляют с помощью EcoRI, экстрагируют фенолом, затем хлороформом, после чего осаждают этанолом и получают вектор. С
1 7
использованием Т -ЛИК-лигазы 0,5 мкг полученного вектора связывают с фрагментом (около 670 п.о.), полученным связыванием синтетического олигонуклеотида с олигонуклеотидом, кодирующим ФИО. IM101 САТСС 33876) трансформируют с использованием полученного выше вектора и культивируют в среде, содержащей 1 мМ ИПТГ и 0,004% (мае./об) х-гал, с получение приблизительно 150 малых колоний. Плазмид,ную ДНК получают из 100 этих колоний и расщепляют с помощью EcoRI. В результате устанавливают, что 12 плазмид содержат предполагаемый EcoRI-фрагмент (приблизительно 670 п.о.). Для проверки направления инсерции 12 вышеуказанных плазмид расщепляют с помощью PvuII и PstI и подвергают электрофорезу на 1,5 мас.% агарозном геле, В результате устанавливают, что четыре плаз- миды содержат целевые фрагменты (приблизительно 1230 п.о. и приблизительно 2600 п.о.) и что направление транскрипции промотора lac UV5 согласуется с направлением транскрипции олигодезоксинуклеотидов,кодирующих ФИО.
Ана-:шз последовательности осно)за- ний показывает, что эти четыре плаз- миды имеют одинаковую последовательность и что промотор lac UV5, синтетический олигодезоксинуклеотид и к-ДНК соответствующим образом сочеДоля выздоровевших
Количество мышей, совершенно излечившихся от опухоли
Количество мьш1ей, использованных для испытания
Результаты представлены в табл.2.
Приме р 2. Колонии E.coli К12 штамма МС1061 трансформируют плаз- мидами pR 18, рВ 2-7 и рЕ 2-2. Колонию штамма МСЮб E.coli культивиру-. ют в среде LB до тех пор, пока оптическая плотность культурального бульона при 550 нм не достигнет значения 0,3.50 мл выросшей культуры E.coli собирают, промывают 25 мл смеси, содержащей 10 МОПС (рН 6,5) и 10 мМ RbCl, и снова суспендируют в 25 мл смеси, содержащей О,1 М МОПС (рН 6,3), 50 мМ CaClij, и 10 мМ RbCl. Результирующую суспензию охлаждают на льду в течение 30 мин, центрифу076901
таются друг с другом. Полученные плазмиды обозначают как рФНО lac UV 5-1.
5 Штаммы E.coli, содержащие плазми- ды, культивируют в 50 мл LB-среды, содержащей аьшициллин в концентрации 100 мкг/мл, при в течение ночи. Затем штаммы переносят в 5 л 10 LB-среды, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мп, и дополнительно культивируют при в течение 3 ч. К ней прибавляют изопро- пил-р -В-тиогалактопиранознц в резуль- 15 тирующей концентрации 1 мМ. Культивирование продолжают еще в течение 6 ч, после чего проводят охлаждение. Затем штаммы собирают центрифугированием. Прибавляют в 5 л буферного 20 раствора 0,04 И Трис-НС1 (рН 7,8), разрушают ультразвуком и получают раствор белков щтамма. Полученный раствор обладает цитотоксической активностью против L-клеток, равной 25 5x107 ед./л.
Полученный раствор очищают таким же образом и получают 1,2x10 ед. ФИО. Удельная активность ФИО равна 6,8x10 ед./мг.
30 Образец (0,2 Мл) ФНО испытывают способом анализа in vivo.
Через 20 дней после инъекции образца делают осмотр дегенерации опу- 35 холей и рассчитывают долю выздоро- вевщих по следующей формуле.
. гируют и суспендируют в смеси 2 мл д5 вьш1еуказанной смеси, содержащей 0,1 М МОПС (рН 6,5), 50 мМ САС1, 10 мМ RbCl и 30 мкл ДМСО. К аликвоте результирующей суспензии объемом 200 мкл отдельно прибавляют по 10 мкл 50 каждого из растворов плазмидной ДИК. Каждую из результирующей смесей охлаждают на льду в течение 30 мин и затем нагревают при 44 С в течение 60 с. Непосредственно после этого J5 к каждой иэ нагретых смесей прибавляют по 5 мл предварительно нагретой до 31°С ЬЗ-среды, после чего проводят инкубирование при 37 в течение 1 ч. Каждый из полученных культураль19
ных бульонов центрифугируют с о б- разованием клеточного осадка. Супер- натант отбрасывают, прибавляют LB- среду и каладый из клеточных осадков суспендируют перемешиванием. Каждую из результирующих суспензий высевают на ЬВ- 1ластинку агара, содержащую тетрациклин в концентрации 30 мкг/мл и затем инкубируют при в течение ночи. В результате получают колонии трансформированных организмов, устойчивых к действию тетрациклина, каждая из которых трансформирована плазмидами pR 18, рВ 2-7 и рВ 2-2.
Трансформированные щтаммы плазмидами рБ 2-7 и pR 18 подвергают следующим операциям: выращивания трансформированного организма, сбор и ли- зирование трансформированного организма и очистка плазмидной ДНК по ме тодике. Каждый из трансформированных штаммов высевают в LB-среду и инкуби руют при и интенсивном встряхивании. Эту стадию повторяют для выращивания трансформированного организма и амплификации плазмид.Культуру трансформированного организма собирают центрифугированием при AOOOg в течение 10 мин при .Супер натант отбрасывают. Результирующий осадок промывают 100 мл охлажденного на ледяной бане НТЭ (0,1 М Had, 10 мМ Трис-НС1, рН 7,8, и 1 мМ ЭДТУ) и лизируют кипячением с использованием 20 мг/мл лизоцима в 10 Трис- НС1, рН 8,0. Вязкий продукт переносят в пробирку ультрацентрифуги и центрифугируют при 25000 об/мин в течение 30 мин при и получают раствор ДНК. Измеряют объем раствора ДНК. На каждьй миллилитр прибавляют точно 1 г твердого хлорида цезия и осторожно перемешивают до полного растворения соли. На каждые 10 мл раствора хлорида цезия прибавляют 0,8 мл раствора бромистого этила (водный раствор с концентрацией 10 мг/мл). Результирующая плотность раствора равна 1,55 г/мл, а концентрация eipoMHCToro этила равна приблизительно 600 мкг/мл. Раствор хлорида цезия переносят в пробирку для центрифугирования и оставшуюся часть пробирки заполняют легким парафиновым маслом. Проводят центрифугирование при 45000 об/мин в течение 36 ч при и получают две полосы ДНК, где верхняя полоса состоит из линей0769020
ной бактериальной и меченой кольцевой плазмидной ДНК, а нижняя полоса состоит из замкнутой кольце- вой плазмидной ДНК. Нижнюю полосу ДНК собирают в стеклянную пробирку с помощью иглы для подкожных инъекций, введенной через боковую стенку
пробирки. Бромистый этил удаляют и 0 водную фазу подвергают диализу против ТАЗ. Раствор плазмидной ДНК обрабатывают РНК-азой и экстрагируют равным объемом фенола. Водную фазу слоев наносят на колонку, уравнове- 15 щенную по отношению к ТАЗ (рН 8,0) и 0,1% ДСН.ДНК в колонке промывают и наносят ТЕ с 0,1% ДСН для сбора фракций. Фракции осаждают этанолом и получают чистую плазмидкую ДНК. 20 По вьшеуказанной методике получают 250 мкг чистой ДНК плазм}щы рВ 2-7 и 134 мкг чистой ДНК плазмиды pR 18.
ДНК плазмиды рВ 2-7 (40.мкг) рас- 25 щепляют рестриктазой PstI и подвергают электрофорезу на 4%-ном акрил- амидном геле. После электрофореза ДНК окрашивают и нужную полосу вырезают для получения вставки PstI.
30 С использованием 500 иг выделенной вставки PstI проводят трансляцию с меткой и 80 пикомоль радиоактивного dCTP прибавляют в 25 мкл реакционной системы (при 400 кюри/ммоль). К смеси, состоящей из 2,5 мкл раствора А (раствор dNTP), 2,5 мкл раствора В (500 нг испытуемой ДНК,а именно вставки PstI); 5 мкл меченой dCTP (3200 кюри/ммоль), 1,3 мкл dCTP без Q метки (65 пикомоль, 50 пмоль/мкл dCTP), 11,2 мкл раствора Е (вода), всего 22,5 мкл, прибавляют 2,5 мкл раствора с ДНК-азу 1, ДНК-полимери- зу 1 и проводят реакцию при 15°С в течение 60 мин. После этого для прерывания реакции к результирующей смеси прибавляют в качестве носителя т-РНК, дважды переосажденную этанолом и растворенную в 500 мкл воды. 5Q Идеальная активность на 1 мкг ДНК равна 9,3x10 имп/мин.
Вьпзеописанные операции повторяют также с чистой ДНК плазмиды pR 18 для проведения трансляции с меткой. Удельная активность на 1 мкг ДНК равг на 7x10 мин/мин.
30 мкг ДНК плазмиды pR 18 расщепляют рестриктазой Rsdl и подверг ают электрофорезу на полиакриламидном
35
45
геле. Указанные ниже полосы целевых вставок вырезают и очищают на колонке: приблизительно 640 п,о., 3,77 мкг (выход 52%), приблизительно 175 п.о., 1,77 мкг (выход 50%),
Указанную выше вставку, имеющую около 640 п.о,, обозначают как 3- фрагмент pR 18 (соответствует 3 -нетранслированному участку pR 13), а вышеуказанные приблизительно 175 п.о обозначают как pR 13-cfr (соответствуют кодирующему участку pR 18).
Кроме того, вьш1еописанные операции повторяют с использованием рест- риктаз PstI и Mstll вместо Rsdl и получают следующую полосу: приблизительно 450 п.о., 3,65 мкг (выход 60% Эту вставку обозначают как 3 -фрагмент pR 18.
Меченую Р вставку плазмиды рВ 2-7 используют в качестве гибри- дизационной пробы для отбора 10 негативных колоний бактериофага Gharon 4А (геномной библиотеки человека,п6- лучаемых в результате введения в E.coRI сайт связывания Charon 4А фрагментов определенных размеров частично расщепленной ДНК человека). При этом используют метод гибридизации негативных колоний. Поскольку не весь бактериофаг в исходной культуре содержит необходимый генетический материал для получения ФИО человека, используют пробу, имеющую последовательность оснований, комплементарную гену ФИО кролика. ДНК негативных колоний фага, содержащую желаемый генетический материал, и радиоактивную метку идентифицируют по проявляемой радиоактивности. Из набора выделяют 9 гибридизованных негативных колоний.
При этом используют следующие методики и условия:
20
+ 0,015 М цитрат натрия, рН 7) - 0,1% додецилсульфат натрия при - погружение 30 мин X 2.
5 5. Выдержка: для рентгеновской пленки ХАР-5 , 2 усиливающих экрана, 39 ч.
В результате проведенного выше отбора были получены 12 потенциальных 10 штаммов-кандидатов. С использованием . описанного способа отбора проводят второй этап отбора, в результате чего были получены 9 штаммов, содержащих требуемый фрагмент. Затем 15 с использованием указанных штаммов проводят третий этап отбора, в результате чего получают 9 штаммон, содержащих указанный фрагмент, С использованием этих штаммов, содержащих указанный фрагмент, проводят четвертый этап отбора, предназначенньш для подтверждения того, что указанные 9 штаммов содержат требуемый фрагмент. Полученные в результате отбора 9 бактериофагов, содержащих требуемый фрагмент, получили обозна-.. чения соответственно HG-I и HG-9,
Используют I0 негативных колоний бактериофага Cliaron 4А/геномной сово- 0 купности кролика, которые получают в результате применения расщепленной ДНК кролика, вместо расщепленной ДНК человека. При этом используют 6,7 X 10 негативных колоний бакте- 5 риофага Charon (геномной библиотеки кролика вместо 10 негативных колоний бактериофага Charon 4А) геномной библиотеки человека, В результате получают два штамма бактериофага 0 (обозначенные PG-I и PG-2), со;Хержа- щие ген ФНО генома кролика.
Получают ДНК бактериофагов HG-3, HG-6 и HG-7,
клеток E,coli LE-392 (клет- 5 ки хозяина) суспендируют в 18 мл среды хранения фага и добавляют к ней 3x1 о ед. образований негативных колоний бактериофага НГ-3, в результате чего осуществляют заражение 0 E.coli в течение 20 мин при .Затем к полученной смеси добавляют 3 л Ыг-бульона и культивируют при встряхивании в течение 23 ч при , К смеси добавляют 60 мл хлороформа,пос- 5 ле чего культуру продолжают встряхивать в течение 30 мин. Затем к смеси добавляют хлористый натрий, доводя его концентрацию до конечного значения, равного I М, после чего смесь
10
. 1607690
оставляют на 15 мин н центрифугируют, отбирая верхний слой. После этого к смеси добавляют полиэтиленгликоль (молекулярный вес около 6000) в таком количестве, что концентрация полиэти- ленгликоля составляет 10% (мае./об), и опять оставляют на 22 ч при . Бактериофаги собирают после центрифугирования. Полученные бактериофаги переводят в суспензию в 28 мл среды для хранения фага и добавляют к сус- ,пензии равный объем хлороформа.После ,перемешивания в течение 30 с реакционную смесь центрифугируют,получая в результате водную фазу. К указанной водной фазе добавляют среду хранения фага до общего объема 30 ип. К полученной смеси затем добавляют 26,4 г хлористого цезия, который осторожно растворяют, после чего подвергают смесь разделению на ультрацентрифуге (45000 об/мин, 20 ч), получая бактериофаги в виде отдельного слоя. Полученную смесь, содержащую бактериофаги, диализируют с использованием растворов 10 мК хлористого натрия - 50 мМ трис(гидроксиметил) аминометана (Трис-буфер) рН 8 10 мМ хлористого магния. После этого к смеси добавляют ЭДТУ, протеиназу К и додецилсульфат натрия в таких количествах, чтобы их концентрации составили соответственно 20 мМ, 50 мкг/мл и 0,5% (мае./об), затем смесь обрабатывают при в течение I ч, после чего экстрагируют фенолом, смесью фенола и хлороформа (1:1 по объему) и затем хлороформом.
24
. ДНК: HG-3 325 иг каад 935 нг каждая; HG-7 685 иг
20
X SSC - 0,1% додецилсульфата 25 при 50°С: погружения 2x30 ми
14 ч.
Результаты гибридизации п 30 ны в табл.3.
35
Используют бактериофаги R RG-2 вместо каждого из бакте HG-3, HG-6 и HG-7. В резуль ходят, что фрагмент 5 pR 18 зован с фрагментами или фра содержащимися в одном слое, мыми в результате расщеплени и RG-2, и кащ1ым из энзимо
получаем, „„„ ,.о„ в„„„ ia,/,: ,„ Ва-Г E oRlTiinrHb. m
ЛИЗИРУЮТ с ИСПОЛЬЯОИЯнме.м л-. „ . niuuiil
лизируют С использованием раствора 10 мМ Трис-буфера (рН 8) - 1 м1-1 ЭДТУ. Измерения поглощения в ультрафиолетовой области для полученной водной фазы свидетельствуют о том, что получают чистую ДНК бактериофага .
Те же самые операции и в той же последовательности, что и описанные в случае получения ДНК бактериофага HG-3, осуществляют с целью получения ДНК бактериофагов HG-6 и HG-7.
В результате получают 2920 мкг HG-3, 1100 мкг HG-6 и 819 мкг HG-7.
Осуществляют анализ полученных ДНК методом пятен по Саутерну. Методика и условия ее осуществл ения следующие:
BamHI + EcoRI.
5,33 мкг полученной при. э HG-3 расщепляют с использов 80 ед. EcoRI при в течен
45 Продукт расщепления подвергаю рофорезу с использованием 1%агарового геля с низкой темпе плавления.
Спой с 2,9 т.п.о. выделяют
5Q рового геля. Часть геля, сод го слой 2,9 т.п.о., нагревают в течение 15 мин. Расщеп EcoRI фрагмент HG-3, имеющий 2,9 т.п.о. (впоследствии обоз
мый HG-3/EcoRI-2,9 т.и.о.-фр выделяют из расплава геля в р тате трехкратного экстрагиров нолом и трехкратного экстраг и этанолом с последующим осажде
0
690
24
. ДНК: HG-3 325 иг каадая; HG-6 935 нг каждая; HG-7 685 иг каждая:
0
X SSC - 0,1% додецилсульфата натрия 5 при 50°С: погружения 2x30 мин
14 ч.
Результаты гибридизации принеде- 0 ны в табл.3.
Используют бактериофаги RG-i и RG-2 вместо каждого из бактериофагов HG-3, HG-6 и HG-7. В результате находят, что фрагмент 5 pR 18 гибриди- зован с фрагментами или фрагментом, содержащимися в одном слое, получаемыми в результате расщепления RG-1 и RG-2, и кащ1ым из энзимов:
Ва-Г E oRlTiinrHb. m
,„ Ва-Г E oRlTiinrHb. m
„ . niuuiil
и
BamHI + EcoRI.
5,33 мкг полученной при. этом ДНК HG-3 расщепляют с использованием 80 ед. EcoRI при в течение 3 ч.
45 Продукт расщепления подвергают электрофорезу с использованием 1%ного агарового геля с низкой температурой плавления.
Спой с 2,9 т.п.о. выделяют из ага5Q рового геля. Часть геля, содержащего слой 2,9 т.п.о., нагревают при в течение 15 мин. Расщепленный EcoRI фрагмент HG-3, имеющий длину 2,9 т.п.о. (впоследствии обозначае мый HG-3/EcoRI-2,9 т.и.о.-фрагмент), выделяют из расплава геля в результате трехкратного экстрагирования фенолом и трехкратного экстраг ирования этанолом с последующим осаждением
25
этанолом, содержащим ацетат аммония В результате отмеченных выше операций получают 637 нг HG-3/EcoRI-2,9 т.п .о.-фрагмента (выход около 30%).
255 нг полученного согласно описанному выше способу фрагмента связывают с 6,5 нг расщепленного EcoRI pUC-13 с использованием 2,5 ед Т4-лигазы при 4°С и продолжительности обработки 20 ч.
Трансформацию E.coli К-12, штамм IM-33, осуществляют с использованием полученного согласно описанному выше способу продукта связывания. E.coli К-12, штамм IM-83, культивируют в среде Дурье-Бертани до того момента, пока оптическая плотность бульона культуры не станет равной 0,3 при 550 нм, 50 мл выращенной культуры E.coli К-12, штамм IM-83, собира- ют, промывают 25 мл 10 мМ раствора морфолинопропансульфокислоты (рН 7,0 10 мМ хлористого рубидия, и вновь суспендируют в 25 мл раств ора 0,1 М морфолинопропансульфокислоты (рН 6,5 50 мМ хлористого кальция - 10 мМ хлористого рубидия. Суспензию охлаждают во льду в течение 30 мин, центрифугируют и вновь переводят в суспен- .зию в смеси 2 мл О,I М морфолинопропансульфокислоты (рН.6,5) - 50 мМ хлористого кальция - хлористого рубидия и 30 мкл ДКСО. К 203 мкл суспензии добавляют 10 мкл водного раствора продукта связывания,содержащего 10 нг продукта связывания. Смесь охлаждают во льду в течение 30 мин, после чего нагревают до в течение 60 с. Немедленно вслед за этим к нагретой смеси добавляют 5 мл среды Лурье-Бертани, предварительно нагретой до 37 , после чего в течение 1 ч осуществляют инку- бирование при 37 С. Получаемый при этом культуральный бульон центрифугируют и удаляют верхний слой,После этого добавляют среду Лурье-Бертани к полученному клеточному концентрату и инокулируют на чашку со средой Лурье-Бертани, содержащий 30 мкг/мл ампициллина и 40 мкг/мл Х-галактози- да. Колонии, содержащие E.coli К-12, штамм IM-33, трансформированный плаз- мидами, содержащими вставки, имеют белый цвет, тогда, как- колонии,содержащие E.coli К-12, штамм IH-33,трансформированный только плазмидами,имеют голубой цвет. Полученные колонии
0769026
оелого цвета вновь инокулируют на чашках со средой Лурье-Бертани,содер- жащей 30 мкг/мл ампициллина и 40 мкг/мл Х-галактазида с целью подтверждения полученного результата.
Из полученных согласно описанному вьщ1е способу белых колоний выбирают 10 колоний (бактериальные клоны), Q которые подвергают отбору с использованием микропрепаратнвной методики. Каждую колонию культивируют в течение ночи в среде, содержащей 30 мкг/мл ампициллина. Растущие клетки собира- J5 ют и переводят в суспензию в растворе, содержащем 2 мг/мл лизоцима - 50 мМ глюкозы - 10 м - ЭДТУ - 25 мМ трис-НС1-буфера (рН 3,0). Суспензию оставляют при комнатной температуре 20 в течение 5 мин,после чего добавляют к ней 200 мкл 0,2 н. гидрата окиси натрия - 1% додецилсульфата натрия. По сле медленного перемешивания суспензию оставляют при комнатной тем- 25 пературе на 2 мин. После этого добавляют 150 мкл 3 М раствора ацетата натрия (рН 5,2), смесь оставляют при -20 С в течение 10 мин, после чего центрифугируют в течение 15 мин,вы- 30 деляя таким образом верхний слой жидкости. К указанному верхнему слою добавляют 900 мкл холодного этанола, после чего центрифугируют в течение 10 мин, получая в результате осадок. Полученньй осадок промывают 70%-ным этанолом и сушат,получая в результате ДНК плазмиды. С использованием описанного вьше способа получают 10 ДНК плазмид.
Каждую из ЛНК плазмид растворяют в растворе 10 мМ Трис-буфера -0,1 мМ ЭДТУ (рН 3,0), расщепляют EcoRI и подвергают электрофорезу для рестрик- ционного анализа. Условия расщепления и проведения электрофореза следующие: расщепление-раствор ЛНК плазмид 1:5 часть от полученного вьш1е количества; EcoRI: 3 ед., З7 с, 1,5 ч; электрофорез - 1%-ный агаровый гель, 5Q 1хТАЭ, 120 В, 2 ч.
35
40
45
55
.Описанный выше рестрикционный анализ показывает, что положительными являются 3 клонов из 10. Это значит, что эти 3 клонов содержат фрагмент с 2,9 тыс.п.о.. Из восьми положительных клонов выбирают один клон,обозначая его как E.coli К-12, штамм IM-83 (рН Ge) (АТСС 39656).
27 , 1
Те же самые операции в той же пос ледовател.нести, как и в описанной выше стадии 2, повторяют для получения 1,39 мг ДНК рН ГЕ, за исключением того, что используют E.coli, К-12 штамм Ш-вЗ (pHGE), вместо E.coli с обработкой с участием рВ 2-7 pR 18, I 30 мкг RG-1 расщепляют E.coRI. Из получаемой при этом смеси фрагмен тов выделяют фрагмент, имеющий длину около 3,5 тыс.п.о. с использованием точно такого же способа, что и описанный выше для стадии 9, за исключе нием того, что используют полученную iранее смесь фрагментов и 0,8%-ный агаровый гель с низкой температурой плавления, 3 результате получают 1,0 мкг расщепленного EcoRI фрагмента PG-1 (3,5 тыс.п.о.). Полученный согласно описанному выше способу расщепленных EcoRI фрагмент PG-1 (3,5 п.о,) связывают с расщепленным EcoRI pUC-13 за исключением того что используют полученный ранее фрагмент, расщепленный EcoRI (3,5 тыс.прО вместо расщепленного FcoRI фрагмента HG-3 (2,9 тыс.п.о,).
Осуществляют трансформирование E.coli К-12 штамм IM-83s отбор бакте риальных клонов, расщепление клонов и электрофорез за исключением того, что используют полученный согласно описанному вьщ1е способу продукт связывания. Полученный клон обозначают E.coli К-12,штамм IM-83 (pRGe) (АТСС 39655), Операции повторяют для получения 1,70 мг ДНК pRGE, за исключением того, что вместо рВ 2-7 и pR 18 ,используют E.coli К-12, штамм IM-83 (pRGE).
Осуществляют рестрикционный энзи- метический анализ ДНК pHGE.
При этом используют следующие one рации и условия:
1 мкг/мл расщепленной EcoRI pHGE; рестрикционные ферменты: 5 ед, PvU|
0769028
11,5 ед. PvuII + 10 ед. Rsal, 10 ед. Rsal, 4 ед. Mst, 11,3 ед. Aval,9 ед. PstI, , 2 ч;
35
дизация: 30 мл ФДНН, 42°С, 6 ч;
3, первая гибридизация: 5 -фрагмент 5x10 имп. в мин/мл pR 18 42 °С 14 ч;
J.5 додецилсульфата натрия при комнатной температуре - 4 погружения по 10 мин; 1 X SSG - 0,1% р-р додецилсульфата натрия при 50°С - 2 погружения по 30 мин.
20 О- выдержка: рентгеновская пленка
XAR-5, 2 усили)ающих экрана, 17,5 ч;
25 ЗхННЦ - погружение мин;
30 РН 2-7, 16,5 ч;
, 15ч;
Осуществляют рестрикционньй ферд5 ментативный анализ ДНК плазмиды
pRGE.
Повторяют те же операции, за исключением того, что используют F,.col: К-12, штамм IM-83 (pHGE), и E.coli 50 12,штамм IM-83 (pP.GE), вместо
E.coli К-12, щтамм МС-1061, с рВ 2-7, и E.coli, штамм MG-1061 с рр 8, Та- , Ким способом получают по 150 мкг ДНК плазмиды pPGE и ДНК плазмиды pHGE.
55
Последовательности основан1ш в pPGE и pHGE определяют согласно способу Каксам-Гильберта.
Последовательность оснований pR 18 сравнивают с последовательностью оснований pRGE, определенной согласно указанному выше способу для выяснения структуры, включая экзон и интрон геля ФИО кролика. Яатем последовательность оснований pRGE сравнивают с последовательностью оснований pHGE с целью исследования гомоло- гичности и согласованности последовательности в области границы между интроном и экзоном.
Полученные согласно описанному
выше способу последовательности осно- jc венно связаны между собой.
RТСАGCT ТСТCGG GCC CTG AGT GAC AAG ССТ СТА GCC САС GTA GTA
НТСАТСТ ТСТCGA АСС CCG AGT GAC AAG ССТ GTA GCC CAT GTT GTARGCAAAC CCGCAA GTG GAG GGC CAG CTC CAG TGG CTG AGC CAG CGT
HGCAAAC CCTCAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG
RGCGAAC GCCCTG CTG CGC AAC GGC ATG AAG CTC ACG GAC AAC CAG
, HGCCAAT GCCCTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG
RCTGGTG GTGCCG GCC GAC GGG CTG TAC CTC АТС TAC TCC CAG GTT
HCTGGTG GTGCCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC АТС TAC TCC CAG GTC
R CTCTTC AGGGGT CAA GGC TGC CGC TCC ... TAC GTG CTC CTC ACT
HCTCTTC /AGGGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC
RCACACT GTCAGC CGC TTC GCC GTC TCC TAC CCG AAC AAG GTC AAC
HCACACC АТСAGC CGC АТС GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC
RCTCCTC TCTGCC АТС AAG AGC CCC TGC CAC CGG GAG ACC CCC GAG
HCTCCTC TCTGCC АТС AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG
RGAG GCT GAG CCC ATG GCC TGG TAC GAG CCC АТС TAC CTG GGG GGC
H .GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC АТС TAT CTG GGA GGG
RGTC TTC CAG TTG GAG AAG GGT GAC CGG CTC AGC ACC GAG GTC AAC
HGTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG АТС AAT
RGAG CCT GAG TAC CTG GAC CTT GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC TTT
HCGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT
RGGG АТС ATT GCC CTG
HGGG АТС ATT GCC CTG
В реактор из нержавеющей стали с рабочим объемом 500 мкл и фильтрами из нержавеющей стали с каждой стороны вводят 20 Мг полистирольной смолы, с которой посредством сукци- натного связывания связан нуклеозид (2,0 мкМ). Смолу обрабатывают бромистым цинком (1 М) в смеси дихлормета- на и изопропанола (35:15) для. удале
ваний, кодирующие ФИО человека и ФИО кролика, приведены ниже. В последовательности оснований в верхнем ряду приводится последовательность оснований, кодирующая ФИО кролика (R), а в нижнем ряду - последовательность оснований, кодирующая ФНО человека (Н), где символ ..... означает, что данная часть последовательности оснований ДНК, кодирующей ФНО кролика, является нулевой и, следовательно, два кодона, прилегающие к этому символу с обоих сторон, непосредст5
ния диметокситритильных защитных групп, промывают последовательно диме- тилформамидом, пиридином и ацетонит- рилом, после чего сушат в потоке азота. К высушенной смоле добавляют раствор нуклеотида с диметокситри- тильными группам (дат-нуклеотида) (20 мкМ) и 60 мкМ мезитиленсульфо- нилнитротриазола в 200 мл пиридина.
Реакцию сочетания осуществляют в течение 20 мин при . Указанный цикл снятия защиты и сочетания повторяют для последовательно взятых нук- леотидов до тех пор, пока олигодеок- синуклеотид желаемого типа не будет
1)5 -AATTCATGTCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAA-3
2)З -GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCTCAGTGTTGGG-5
3)5 -GGCTGTAGGCCATG rTGTAGGAAACCGTGAAGG-з
4)З -ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTGGAGT-S
10 мкг плазмиды pHGE расщепляют 20 ед. E.coRI. После проведения электрофореза на 1 %-ном агаровом геле с низкой температурой плавления элюируют фрагмент длиной 2,9 тыс.п.о. Этот фрагмент вводят во фрагмент E.coRI на репликативной формы фага М-13 гар-9. Фаг тр9 выбран постольку, поскольку он особенно хорошо подходит для удержания частей ДНК. Продукт переводят на E.coli IM-103. Полученный продукт обозначают Ml 3 mp9-HGE.
Получают одноцепочечную ДНК М-13 np9-HGE..
Олигодеоксинуклеотид З -ACATGGGG TACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT-5 полученный согласно описанному на стадии 14 способу, используют в качестве електора для интрона-3. Делектор для интрона-3 обозначают ЕЗ-4.
Делектор ЕЗ-4 имеет последовательность оснований, комплементарную последовательности оснований перед (экзон 3) и после (экзон 4) интро- на 3, который подлежит делеции. Деле- цию интрона 3 осуществляют следующим образом.
ЕЗ-4 (164 нг, 15 пмоль) фосфори- ирутот с использованием Т4-киназы (10 ед) и АТФ (3 мМ) и добавляют к матрице М-13 mp9-HGE (1,65 мкг, 0,5 пмоль). Реакционную смесь нагревают при в течение 10 мин, охаждают до комнатной температуры в течение 5 мин и наконец охлаждают в смеси воды со льдом. К аАТФ, dGTФ, dGTO, атТФ и АТФ (0,4 мМ) добавляют рагмент Кленова (5 ед.), Т4-лигазу (10 ед.) в Hin буфере 10 мМ Трис-НС1- буфере (рИ 7,2), 2мМ хлористого магния и 1 мМ р -меркаптоэтанола. Реаксвязан со смолой. Затем смолу обрабатывают таким образом, чтобы снять с нее олигодеоксинуклеотид, и очищают.
В результате получают следующие олигодеоксинуклеотиды:
0
5
0
5
0
5
0
5
ционную смесь (конечный объем 50 мкл) инкубируют в течение 30 мин при 4 С, а затем в течение 30 мин при комнат- . ной температуре, ДНК,, полученную при реакции основного олигонуклеоти- да, используют для трансфекдии Е.со-- 11 IM-103. Полученные колонии переводят в чашки УТ. Полученные колонии гибридизуют при 55°С в течение 2 ч
а§
С меченым Р ЕЗ-4. Для этой стадии Делектор используют в качестве пробы для и ентификации последовательностей ДНК, имеющей соответствутощую комплементарную последовательность оснований после интрона, подлежащего делеции. Фаг выделяют из тех колоний, которые гибридизованы с делектором.
Полученный при этом фаг помещают в чашку, и негативные колонии переводят в чашки УТ. Клоны оставляют для гибридизации при 55 с в течение 2 ч с меченым фосфором Р ЕЗ-4.При этом получают положительные клоны, а ДНК фага секвениру;от для выбора такого фага, в котором интрон 3 полностью делетирован. Фаг такого рода обозначается как p9-HGEA 3-1.
Репликативную форму тр 9-HGe ДЗ-1 расщепляют посредством E.coRI.Фрагмент EcoRI вьщеляют и клонируют в EcoRI - расщепленный pBR-327,получая плазмиду pHGE 3-1.
Конструирование остальных плазмид осуществляют с использованием плазмиды pHGE U3-I для получения такой плазмиды u.3-i, которая была бы способна к прямой экспрессии ФИО в E.coli с использованием lacIJV 5 в качестве промотора. Вначале 10 мкг плазмиды pHGE аЗ-1 расщепляют 10 ед AVal и EcoRI при 37°С в течение 2ч и подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле (4 мас.%) для выделения фрагментов. В результате электроэлюирования из геля выделяют примерно 1 мкг фрагмента. Синтезируют два олигодеоксинуклеотида, а именно З -ААТТСАТСССАТСТТСТССААСС-З и 5 -TCGGGGTrCGAGAAGATGACATG-3 . Затем 5 -конец каждого из указанных двух олигодеоксинуклеотидов (примерно 100 пмоль) фосфорилируют с использованием Т4-полинуклеотидной киназы. После окончания реакции реакционную смесь экстрагируют сначала фенолом, а затем хлороформом. Затем полученны описанным выше способом синтетически олигомеры смешивают с 0,5 мкг полученного ранее с использованием IО ед 14-лигазы в соответствии Aval-EcoRI фрагмента плазмиды pHGE ДЗ-1 и осаждают этанолом. Указанные фрагменты связывают в течении ночи при с использованием. После окончания реакции реакционную смесь осаждают этанолом, после чего осуществляют элект- рофорез на полиакриламидном геле (4 мас.%) для выделения указанного фрагмента электроэлюированием.
1 мкг рОр 95-15 расщепляют F.coRI и экстрагируют сначала фенолом, а за- тем хлороформом, после чего, осаждают этанолом, получая при этом вектор. 0,5 мкг полученного ранее вектора связывают с полученным ранее фрагментом с применением Т4-ДНК-лигазы. Трансформируют E.Coli IM-101 (АТСС 33876) с использованием полученного ранее вектора, после чего культивируют ее на агаровой среде, содержащей 1 мМ изопропилтиргалактазида (ИПТГ) и 0,004 нас./об, Х-галактазида,получая в результате около 100 белых колоний.
ДНК плазмиды получают из указанных трансформантов и расщепляют ее посредством EcoRI для идентификации тех плазмид, которые содержат соответствующий EcoRI фрагмент. Для исследования направления введения указанные плазмиды расщепляют посредст- вом PvuII и Pvul и подвергают электрофорезу на агаровом геле (1,5 мас.%) для селекции плазмид, образующих фрагменты длиной примерно 1280 пар оснований и около 260.0 пар оснований, что показывает, что направление транскрипции lac-UV-5 промотора находится в соответствии со случаем оли- годеоксинуклеотидоа, кодирующих ДНК.
JQj 20 25
зо Q
45 со
35
5
Анализ последовательности оснований показывает, что указанные 2 плазмиды имеют ту же самую последовательность, и что lac-UV-5 промотор,синтезированный олигодеоксинуклеотид и ДНК надлежащим образом связаны друг с другом. Полученную в результате плазмиду обозначают рЧФНО-lacUV 5-2 (pHTHF-lacUV 5-2).
E.coli, содержащую рЧФНО-1ас UV 5-2, культивируют на обычной питательной среде. Физиологические испытания продукта на ФИО-активность показывают наличие такой же активности, которая достигается в случае плазмиды рЧФНО-lacUV 5-1, содержащей ФИО-ген кролика при контролировании с использованием 1ас-промотора.
ПримерЗ.С использованием плазмиды pHGE и олигодеоксинуклеотидов 1-4, полученных с использованием методики, получают рЧФНО-lacUV 5-1 (рНТ HF-lacUV 5-1).
E.coli, содержащую рЧФНО-lacUV 5-2, культивируют в обычной питательной среде и индуцируют согласно известным способам. Затем E.coli культивируют с целью получения клеток E.coli, содержащих физиологически активные вещества, которые использутот согласно изобретению. Клетки собирают после центрифугирования и подвергают лизисной обработке при облучении ультразвуком в 1 л 0,04 М Трис-НС1- буфера (рН 7,8), получая в результате клеточный экстракт, содержащий физиологически активное вещество.- Клеточный экстракт обладает цитоток- сической активностью 4,5x10 ед/л. Удельная активность активного вещества в экстракте составляет 3,0 х X 10 ед/мг протеина.
Затем экстракт подвергают обработке на колонке, наполненной DEAE- сефарозой CL-6B, уравновешенной относительно 0,04 М Трис-НС1-буфером (рН 8,0), и после этого элюируют с применением 0,04 М Трис-НС1-буфера (рН 8,0). Колонку промывают 0,04 М Трис-НС1-буфером (рН 8,0) и после этого элюируют с применением 0,04 М Трис-НС1-буфера (рН 8,0), содержащего О, 1 М хлористого натрия. Активные фракции собирают и концентрируют в результате проведения ультрафильтрации, после чего получают неочищенный раствор, содержащий активное вещество, имеющее удельную активность
4,0х10 ед/мг протеина. Полученньи согласно описанному вмяе способу неочищенный раствор подвергают обработке на колонке, заполненной Сефа- крилом S-200, уравновешенной относительно 5 Ml-l фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 0,15 М хлористого натрия, после чего осугаествляют гель-фильтрацию с использованием того же буфера. Активные фракции собирают вместе и. концентрируют в результате проведения ультрафильтрации, получая раствор, содержащий физиологически активное вещество, имеющее удельную активность, равную 7,0 х X 10 ед/мг протеина. Аликвоту полученного согласно описанному выше способу раствора разбавляют 5 мМ фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,15 М хлористого натрия, получая раствор физиологически активного вещества, имеющий цитотоксическую актиность, равную 120 ед/мл.
Аликвоты полученного согласно спи санному вьппе способу раствора добавляют отдельно к альбумину сыворотки человека бычий альбумин, получают образцы раствором, имеющие концентрации альбумина, приведенные в табл.4 Для каждого из полученных образцов растворов определяют остаточную актиность по отношению к образцам,которы соответственно выдерживают в течение 2, 7 и 30 сут при . При проведении описанного выте испытания в качестве контрольного образца используют раствор активного вещества, в которы не вводился альбумин.
Для определения остаточной активности исследуют активность каждого из образцов in vivo или in vitro.Пр исследовании in vitro ocTaTO4HyKi активность рассчитывают из опытного значения согласно следующему уравнению:
Остаточная активность
f7 - ---- (/) - JJ
X 100,
где А - цитотоксическая активность образца после физической обработки или хр- нения;
В - ;итотоксическая активность образца до физической обработки или хранения.
При исследовании in vivo каждый образец раствора концентрируют,достигая степени концентрации 20 по сравнению с исходным раствором. Затем
10
5
0
7690
50
5
0
5
36
по 0,5 мл ка здого из сконцентрированных подобным способом растворов вводят через хвостовую вену каждой из мышей (в группах по 5 животных),зараженных опухолями. Противоопухолевую активность исследуют спустя 24 ч в соответствии с приведенными ниже критериями .
П р и М е р 4, Для каждого из растворов определяют остаточную активность в отношении: образцов, прошедших соответственно однократный или трехкратный цикл замораживания до и таяния,, и образцов, подвергшихся замораживанию до -70°С, лио- фшшзации и хранению при комнатной температуре в течение 7 сут. При проведении описанного выше испытания в качестве контрольного образца используют раствор активного вещества, не содержащий альбумин. Что касается лиофилизированной пробы, то ее растворяют в стерильной дистиллированной воде, после чего испытывают образец на цитотоксическуго активность. Испытывают in vivo или in vitro остаточную активность каждого образца.
Пример5. К аликвотам добавляют ФЫО человека по отдельности в различных концентрациях вещества, которые являются хорошо известными стабилизирующими агентами для растворов обычных физиологически активных веществ, в частности разл -1чные аминокислоты, соли металлов и хелатообра- зующие агенты. Каждый из полученных при этом растворов хранят при в течение 7 сут, после чего испытывают на наличие противоопухолевой активности согласно методу испытаний in vivo. Остаточную активность опреде- ляют расчетным методом, описанньпч вьппе.
Полученные результаты сведены в табл.5.
50
Формул
изобретен
и я
Способ стабилизации рекомбинантно- го фактора некроза опухоли, включающий добавление к водному раствору, содержащему фактор некроза опухоли, с цитотоксической активностьро по отношению к L-M клеткам, равной 10 -10 ед/мл, вызывающему геморра- ) ичecкш некроз трансплантированной
.37160769038
MethA саркомы в мьшках ВАЪВ/С.кото- „ характеризуется следующей . рыи кодируется pHTMF-lacUV 5-2 плаз-, последовательностью ами„о и™Г I
Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-AlaHis-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Glu-Gly-Gln-Leu-Gln-Trp-Leu-Asn-Arg-Arg-Ala-Asn-Ala-Ley-Leu-Ala- Asn-Gly-Val-Glu-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Ley-Val-Val- Pro-Ser-Glu-Gly-Leu-Tyr-Leu-The-Tyr-Ser-Gln-Val- Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val- Leu-Leu-Thr-His-Thr-Ile-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser- Tyr-Gln-Thr -Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys- Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Tlir-Pro-Glu-Gln-Ala-Glu-Ala- .Lys-Pro-Irp-Tyr-Glu-Pro-Ile-Tyr-Leu-Gly-Gly-Val- Phe-Gln-Leu-Alu-Lys-Gly-Asp-Arg-Leu-Ser-Ala-Glu-Ile- Asn-Arg-Pro-Asp-Tyr-Leu-Asp-Phe-Ala-Glu-Ser-Gly- Gln-Val-Tyr-Phe-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu- |И нуклеотидной последовательностью
TCA ТСТ ТСТ CGA АСС CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG GAG CTG GAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAG GTC АТС TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC
CAC ACC АТС AGC CGC АТС GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC
CTC CTC TCT GCC АТС AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG AGC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC ,TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA GTC AGC GCT GAG АТС AAT , CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG АТС ATT GCC CTG
человеческого сывороточного альбу- водного раствора, мина в количестве 10 у 50 мг на 1 мл . .
Число ренату- рирован- иых п ар оснований
2-2 2-3 2-7 9 12 13 25 322
400
800
1060
1550
1400
1350
1350
0
I
a 2
Введенное инъекцией Количе- Оценка активности образцов .Поля выз- количество кроличье- ство мы- через 1 день доровевших
го ФИО, выработанно- шей,ис- черем
го E.coli, ед./мышь пользо- - + ++ +++ I 20 дней
в анных для испы- ISiiyS
2 X 0014 5/5
Контроль (физиологический солевой раствор)5 5000 0/5
т л 5 ,-; ;i LI ;l 3
jHLiiii Клоп (Rax-j (ПроРл pR 13)
териофлг) К Ра:эмпр гибридизированного 1 фрагмента , т.п.о,
J Копен 5Конец З
HG-3 HG-6 11(7-7 KC-3 H(.;-6 HG-7 НГ,-3 HG-6 HG-7 HG-3 HG-6 HG-7 HG-3 HG-6 HG-7 HG-3 HG-6 HG-7
6,7 1 :,2 9,2 2,9 2,4 2,9 2,9 2,9 2.9 2,9 2,9 2,9 9,7 1,1 9,7 2,2 1.9 2,2
Примеч ание. Символ «- обозначает гибрндиэаито того «е самого фрагмента.
Таблица 1
Цитотокси- ческая активностьпротив Lклеток,ед/мл
35
;io
10 10 15 -ilO 10 10
0,° 0,9 0,9
Нет (контроль) - HSA
HSA
BSA
Примечания.
Цифры в колонках, относящихся к испытаниям in vitro, представляют собой остаточную актнвность согласно данному выие определению. Цифры в колонках, отяосяшиеся к испытаниям in. vivo, представляют собой число нышей
ТаблицаЗ
Стабилизирующий агент
Нет (контрольный)
HSA
Глицин
L-Лизин
L-Аргинин
L- Гл ют амино в ая
кислота
Хлористьй
кальций
Хлористьй магний
ЭДТА
Таблица
1 j Остаточная
активность, % хранение при в течение 7- су т
