Способ получения распластанных мейотических клеток для ультраструктурного анализа мейоза на уровне синаптонемных комплексов Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к цитогене- тике, в частности к технике приготовления препаратов мейотических клеток для ультраструктурного анализа мейоза на уровне синаптонемных комплексов

1

(СК) и может быть использовано как для фундаментальных исследований мейоза, так и для решения задач прик- - ладной цитогенетики (выявление различных нарушений синапсиса хромосом,

транслокаций и других хромосомных аномалий, невидимых в световом микроскопе) .

Целью изобретения является упрощение способа и увеличение числа получаемых на одном препарате клеток, пригодных для анализа СК.

Предложенный способ предусматривает приготовление суспензии мейоци- iQ тов в гипотоническом растворе сахарозы, нанесение этой суспензии на предметное стекло, которое покрыто нитроцеллюлозной пленкой, смоченной раствором фиколла, высушивание пре- 15 парата на воздухе, фиксацию парафор- мальдегидом, окрашивание клеток спиртовым раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты и перенос на электронно-микроскопические сеточки.20

В отличие от известного способа суспензию мейоцитов готовят не на физиологическом растворе, а на 0,1 М растворе сахарозы, и наносят капли гипотонического раствора не на по- 25 верхность, а непосредственно на поверхность предметного стекла со специально подготовленной гидрофильной электронно-прозрачной пленкой, после чего препарат высушивают на воздухе. 30

Благодаря этому, во-первых, отпадает необходимость в проведении двух достаточно сложных операций (нанесения клеток на каплю гипофазы и переноса их с ее поверхности на покров- с ное стекло), а во-вторых, появляется возможность одномоментного получения препарата с гораздо большим, чем„ в прототипе, числом пригодных для анализа СК клеток.40

Кроме того, изобретение включает новый,более простой вариант получения и обработки электронно-прозрачной пленки: используют нитроцеллюлозное покрытие, которое перед нанесением 5 суспензии мейоцитов смачивают 0,01- 0,02%-ным раствором фиколла0

В целом совокупность предложенных методических приемов в несколько раз повышает эффективность анализа и прежде всего использования предназначенного для исследования СК биологического материала.

Пример. Семенники гусениц тутового шелкопряда или домовой мыши или пыльники кукурузы препарируют в 0,1 М растворе сахарозы. Их содержание извлекают и пипетируют,

Q 5 0

5 0

с 0

5

5

а затем наносят на электронно-прозрачную пленку следующим образом. Предметное стекло, покрытое электронно-прозрачной пленкой (для этого его погружают в 0,6%-ный раствор нитроцеллюлозы в амилацетате, вынимают и высушивают), смачивают в растворе фиколла с концентрацией 0,01-0,02%. Избыток раствора удаляют, .прикасаясь краем стекла к фильтровальной бумаге. На влажную поверхность пленки наносят 10-20 мкл суспензии мейоцитов, после чего стекло высушивают на воздухе. Препараты далее фиксируют 10 мин в 10 мМ борат- ном буфере рН 8,5, содержащем 4% па- раформальдегида и 3,4% сахарозы. Перед употреблением в раствор фиксатора добавляют додецилсульфат натрия до конечной концентрации 0,04%. После фиксации предметные стекла промывают 15 с в 10 мМ боратном буфере рН 8,5 и высушивают на воздухе. Распластанные мейоциты анализируют в фазово-контрастном микроскопе. Участки пленки, содержащие мейоциты с хорошо распластанными и недеформируемыми СК, обводят острой иглой. Препараты окрашивают 10 мин 2%-ным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты в 50%-ном этаноле, промывают последовательно в 70%-ном и 95%-ном этаноле и снова высушивают на воздухе. После нанечения дистиллированной воды на предметное стекло возле надрезов и ее проникновения под пленку вырезанные участки пленки всплывают и их переносят на электронно- микроскопические сеточки.

Предложенный способ позволяет стабильно получать из 2-4 семенников гусениц 200-400 распластанных мейоцитов, пригодных для анализа мейоза на уровне СК. Способ является универсальным, поскольку он применим для исследования мейотических клеток как животного, так и растительного происхождения.

Применение изобретения при решении задач фундаментальной и прикладной цитогенетики позволит более просто, чем в прототипе, получать качественные препараты распластанных мейоцитов, пригодные для исследования СК, более эффективно использовать предназначенный для анализа биологический материал.

ормула

5 з о

14

брете ния

1. Способ получения распластанных мейотических клеток для ультраструктурного анализа мейоза на уровне синаптонемных комплексов, включающий приготовление суспензии мейоцито их распластывание и связывание со стеклом, покрытым гидрофильной электронно-прозрачной пленкой, с последующей фиксацией и окраской клеток и перенесением пленки на электронно- микроскопические сеточки, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и увеличения числа

,

6

получаемых на одном препарате клеток, пригодных для анализа синаптонемных комплексов, суспензию мейоцитов готовят в гипотоническом растворе сахарозы, наносят ее непосредственно на предметное стекло с влажной электронно-прозрачной пленкой и перед фиксацией высушивают на воздухе.

2. Способ поп.1,отличаю- щ и и с я тем, что в качестве влажной гидрофильной электронно-прозрачной пленки используют нитроцеллюлоз- кую пленку, смоченную в 0,01-0,02%- ном растворе фиколла.

Изобретение относится к цитогенетике , в частности, к технике приготовления препаратов мейотических клеток для ультраструктурного анализа, и может быть использовано как для фундаментальных исследований мейоза, так и для решения задач прикладной цитогенетики (выявление различных нарушений синапсиса хромосом, транслокаций и других хромосомных аномалий, невидимых в световом микроскопе). Целью изобретения является упрощение способа получения распластанных мейоцитов для ультраструктурного анализа мейоза на уровне синаптонемных комплексов (СК) и увеличение числа получаемых на одном препарате клеток, пригодных для анализа СК. Предложенный способ предусматривает приготовление суспензии мейоцитов в гипотоническом растворе сахарозы, нанесение этой суспензии на предметное стекло, которое покрыто нитроцеллюлозной пленкой, смоченной раствором фиколла, высушивание препарата на воздухе, фиксацию параформальдегидом, окрашивание клеток спиртовым раствором фосфорновольфрамовой кислоты и перенос пленки на электронно-микроскопические сеточки. Нанесение суспензии мейотических клеток в гипотоническом растворе непосредственно на специально подготовленную поверхность предметного стекла, а также метод подготовки этой поверхности, включающий покрытие ее нитроцеллюлозной пленкой и смачивание пленки перед нанесением клеток раствором фиколла обеспечивает упрощение отдельных процедур и сокращение их числа и позволяет получать препараты, содержащие в несколько раз больше хорошо распластанных мейоцитов с недеформированными СК, чем в случае способа-прототипа. При этом достигаемое упрощение и повышение эффективности способа не приводит к ухудшению качества препаратов. 1 з.п. ф-лы.