Способ подготовки препаратов бактериальных клеток к электронно-микроскопическому исследованию Советский патент 1985 года по МПК G01N1/38 A61B10/00 G01N1/42 

S

4

СО 00

Изобретение относится к микробиологии, в частности к исследованию водорастворимых биопрепаратов в обезвоженном состоянии электронной микроскопией, и может быть использовано для ультраструктурного анализа высушенных и лиофилизированных тканей и клеток, бактерий и бактериальных вакцин, вирусов и вирусных вакцин в обезвоженном состоянии (в анабиозе).

Цель изобретения - предупреждение изменений ультраструктуры сухих водорастворимых препаратов.

Способ осуществляют следующим образом.

Препарат бактериальной клетки пропитывают в 1%-ном растворе формвара на дихлорэтане в течение 510 мин, полученную суспензию наносят на плашку и замораживают в жидко фреоне-22, охлажденном жидким азо. том, в течение 5 с, затем препарат переносят в жидкий азот для окончательного замораживания. Замороженный препарат скалывают на охлажденном столике при температуре от -150 до в вакуумно-замораживающей установке (2x10 torr).

На сколотуюповерхность образца напыляют платину из катодной пушки в течение 8 с, и укрепляют углеродом в течение 15 с. Реплику снимают с поверхности образца в 40%-ном водном растворе хромовой кислоты в течение 24 ч. Затем реплику промывают дважды в бидистиллированной воде по 20 мин каждый раз. Далее реплики монтируют на медные злектронномикррскопические сеточки и изучают их в элек тронном микроскопе.

В таблице представлены результаты криофрактографического анализа сухих водорастворимых биопрепаратов, препарированных по данному способу.

Плоскость скола проходит через ча тицы биопрепарата или их естественные поверхности.,Биопрепарат состоит из частиц округлой или овальной форы отдельные частицы-биопрепарата(примерно 10% ) имеют диаметр 13,0-20,0 мк В частицах биопрепарата выявляют клетки биоагента, равномерно распредленные в защитной среде. На таких сколах также можно исследовать ультраструктурную топографию бактериальных клеток в биопрепарате. Клетки сжаты и имеют длину 1,1-1,5 мкм, ширина .О, 15-0,24 мкм. Цитоплазма клетки имеет гранулярно-фибриллярное строение. В результате прохождения плоскости скола через мембраны бактерии на криофрактограммах выявляют выпуклую (PF) и вогнутую (EF) поверхности внещней и цитоплазматической мембран. На PF-поверхности внешней и цитоплазматической мембран обнаруживаются глобулярные (полиферментные) частицы. Таким образом, препарирование предлагаемым способом обеспечивает полную сохранность ультраструктурной организации биопрепаратов. На криофрактограммах,-полу- ченных таким способом, можно провести фракционно-дисперсный анализ бйоjпрепаратов, т.е. определить форму, размеры и количественное распределение частиц биопрепарата по размерам. Способ также позволяет исследовать характер распределения клеток биоагента в частицах препарата. На таких криофрактограммах также можно исследовать ультраструктурную топографию мембран и клеток биопрепарата.

Пример 1. Для исследования используют два сухих водорастворимых биопрепарата. Биопрепараты (2 мг ) пропитывают в течение 1 мин в 0,2 МП 1%-ного раствора формвара на дихлорэтане. Полученную суспензию наносят на металлическую плашку и замораживают в жидком фреоне-22, . охлажденном жидким азотом в течение 5 с, затем образец переносят в жидкий азот для окончательного замораживания.. Замороженный образец скалываю на охлажденном столике (-170°С) в вакуумно-замораживающей установке.(2х У- 50 torr). Реплику препарируют, ка описанным способом.

Пример 2. Биопрепараты (2 мг ), указанные в примерах I и 2, пропитывают в течение 10 мин в 0,2 мл 1%-ного раствора формвара на дихлорэтане. Затем суспензию наносят на металлическую плашку и замораживают в жидком фреоне-22 на охлажденном столике (-170°С1 в вакуумнозамораживающей установке (2 х X 10 torr ), Дальнейшее препарирование реплик производят аналогично описанному.

Пример 3. Сухие водораство- ; римые биопрепараты, указанные в примере 1, по 2 мг каждый, пропитывают в течение 5с, 1 и 10 мин в 0,2 мл 1%-ного раствора формвара н дихлорэтане. Полученные суспензии наносят на металлические плашки и замораживают в жидком фреоне-22 в т чение 5с, затем переносят в жидкий азот для окончательного замораживания. Замороженные образцы скалывают на охлажденном столике при -160с в вакуумно-замораживающей установке (2 к 10 torr). Реплики с поверхности сколов указанных образцов препарируют аналогично. Пример 4. Исследуемые биопрепараты по 2 мг каждый пропитывают в 0,2 мл 1%-ного раствора форм вара на дихлорэтане в течение 5 с, 1 и 10 мин. Полученные суспензии на носят на поддерживающие диски и замораживают в жидком фреоне-22, охлажденном жидким азотом, в течение 5 с, затем переносят в жидкий азот для окончательного замораживания. Замороженные образцы скалывают на охлажденном столике при - 150°С в вакуумно-замораживающей установке (:2 X 10 torr ). Реплики препарируют аналогично описанному. Электронно-микроскопический анализ реплик с поверхности сколов сухих водорастворимых биопрепаратов показывает, что при пропитывании биопрепаратов в 1%-ном раствор формвара на дихлорэтане в течение 5с, 1 и 10 мин и скалывании в вакуумно-замораживающей установке (2 МО torr) при температуре столика от ультраструктурная топография частиц биопрепаратов и клеток биоагента полностью сохраняется (таблица ). Плоскость скола проходит через, частицы биопрепарата или их естественные поверхности. В частицах биопрепарата выявляют бактериальные кл ки, равномерно распределенные в запщтной среде. Скол проходит также через естественные поверхности бактерии или через гидрофобные зоны вы шей и цитоплазматической мембран кл ток. В результате прохождения скола через гидрофобную зону мембран н криофрактограммах выявляют PF (выпу лая) и HF (вогнутая) поверхности внешней и цитоплазматических мембран. На PF-поверхности внешней и ци топлазматических мембран обнаруживй глобулярные (полиферментные) части цы. Изучение плотности, величины, лабильности таких частиц на поверхности мембран бактерии в обезвоженном состоянии (в анабиозе ) представляется важным при морфофункциональной оценке сухих водорастворимых .биопрепаратов и клеток, заключенных в них. Исследование криофрактограмм такИх обьектов показывает также, что скол проходит и через цитоплазму клетки. Цитоплазма клеток в обезвоженном состоянии имеет фибриллярногрануляториое строение. Фибриллярные образования цитоплазмы соответствуют структурам нуклеотида. Таким образом, выдерживание сухих водорастворимых биопрепаратоа в 1%ном растворе формвара на дихлорэтане при их препарировании для криофрактографического анализа обеспечивает качественное и равномерное замораживание образца, что позволяет сохранить ультраструктурную топографию биопрепарата и клеток, заключенных в нем. Электронно-микроскогшческий анализ реплик с поверхности сколов сухих водора.створимых биопрепаратов, пропитаных в 1%-ном растворе формвара на дихлорэтане в течение 5с, 1 и 10 мин и сколотых в вакуумно-замора-, живающей установке ( 2-10 torr при температуре столика - 140°С показыает, что реплики при их препарировании начительно повреждаются . Это объясяется тем, что при температуре и выше дихлорэтан испаряетйя табл. 1 ). Изобретение обеспечивает сохранность ультраструктурной топографии сухих водорастворимых биопрепаратов в процессе их препарирования для криорактографического анализа, позволяет изучить форму, размеры, ультраструктуру частиц биопрепаратов и характерраспределения в них бактериальных клеток, позволяет исследовать естественную поверхность частиц биопрепарата, изучить ультраструк турную топографию естественных оверхностей клеточных структур и внутренних областей мембран бакерий в обезвоженном состоянии IB анабиозе ).

ухие водо-1%-ный растастворимыевор формвара

иопрепаратына дихлорэта5сне

5

То жеТо же

5

5

1 мин

1 1 1

10 10 10 10

IIII

Сухие водораст- Минеральное воримые биопре- масло параты

+ + +

+ +

+ +

СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК К ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ путем пропитывания образцов, замораживания, скальшания и репликации сколотых поверхностей, о т л и ч а ю- щ и и с я тем, что, с целью предупреждения изменений ультраструктуры сухих водорастворимых препаратов, пропитывание проводят в 1%-ном растворе формвара на дихлорэтане в течение 5-10 мин, а замораживание и скалывание ведут при температуре от -150 до . О)