Способ получения меченого @ J @ -тромбина Советский патент 1990 года по МПК A61K51/08 A61K101/02 A61K121/00 

1

Изобретение относится к медицине, - в частности к биохимии и гематологии и касается нового способа получения «/-тромбина (КФ 3.4.21.5), меченого «М.

Цель изобретения - повышение специфической активности ai тромбина - J.

Способ осуществляется следующим образомо

Выделяли протромбин из крови человека. Затем иодировали его 1 SJ хлораминовым методом и активировали в среде, содержащей тканевый тромбо- пластин, ионы кальция, факторы свертывания крови Ya и Ха. Активационную смесь помещали на колонку с ДЭАЭ-цел- лкшоэой для отделения нетромбиновых лродуктов активации. « -Тромбин - nsJ очищали далее методом хроматогра- фин.

Пример 1. Из 450 мл плазмы крови человека получили 23 мг протромбина с удельной биопогической активностью 1345,6 ед/мг. Полученный протромбин метили 125J. Для этого в полиэтиленовую пробирку внесли 1,25 мл раствора протромбина с концентрацией 17,8 мг/мл в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4. Добавили к этому раствору 0,05 мл раствора Na 2JJ с радиоактивностью 1 мКи и 0,2 мл раствора хлорамина Т (2 мг/мл). Инкубировали 30 с. Затем внесли 0,3 мл О,1 М раствора метабисульфита натрия и 0,3 мл 0,1 М раствора йодистого калия. Для отделения протромбина - 2SJ от свободного иэотропа проводили гель-фильтрацию реакционной смеси на колонке (1,6 х 15 см) с сефадек- сом G-25, уравновешенным 0,05 М тряс- НС1 буфером рН 7,4.

Получили протромбин - |75J с удельной радиоактивностью 2,05х 107расп /мнн/мг (669,6 JGi/Моль) и свертываюгри активностью 549,4 ед/мг. К 14,4 мл

(Л

с

.Ј -4

4

СЈ

(СО vJ

раствора протромбина - 11fJ в 0S05 M трис-HCl буфере рН 7,4, содержащего 2,5 мМ CaCl., добавили 1 мл суспензии тромбопластина (35 мл/мл) и но 0,1 мл свежей плазмы и сыворотки0 Активацию проводили в течение 2,5 ч при 37°С, контролируя прирост биоло гической активности тромбина в смеси После активации смесь центрифу- гировали 20мин при 7000g и 4 С Тромбин очищали далее хроматогра- фией на колонке О 6 х 10 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,05 М фосфатным буфером рН 6,5. Фракции элюата, содержащие (/-тромбин - , нанесли на колонку (0,8 х 10 см) с SP-сефадексом,, уравновешенным 0,05 М фосфатным буфером рН 6,5. « -Тромбин элюировали 0S15 M фосфатным буфером рН 6,5, Получили 3 мг i-тромбина - nstJ с удельной радиоактивностью 4,18 х 107расп/мин/мг (683ЭУ Ки/Моль) и со свертывающей активностью 255298 ед/мг. d tpoM- бин - n5J давал одну белковую полосу при электрофорезе в полиакриламнд ном геле„

Пример 2. Из 550 мл плазмы человека получили 26 мг протромбина с удельной- биологической активностью 1443 ед/мос Протромбин метили . как и в первом примере, используя 1,13 мл его раствора с концентрацией 22,9 мг/мп и 0,048 мл раствора

5

0

5

0

5

На с радиоактивностью 1,14 мКи. Получили протромбин -f55J с удельной радиоактивностью 4,6 х 10 расп/мин/мг (1509, 03 Ки/Моль) и с биологической активностью t022, 0,5 ед/мг. Активацию протромбина - nej и очищение « -тромбина - nsJ проводили также как и в первом примере. Получили 3,5 мг о( тромбина - fzfj с удельной радиоактивностью 3,3 х х 107 расп/мин/мг (548,7 Ки/Моль) и со свертывающей активностью 2687,5 ед/м„

Свертывающая активность «/тромбина - 25J 2356,8+461,1 ед/мг.

Свертывающая активность о( тромбина - ifJ, полученного известным способом, 362,5±254,1 ед/мг.

Формула изобретения

Способ получения меченого t45J - с(-тромбина путем инкубации Ј-тромбина с раствором Na nsj в растворе хлорамина Т с последующей очисткой . хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и SP-сефадексе, отличающи Й- с я тем, что, с целью увеличения специфической активности, радиоактивную метку инкубируют с неактивной формой of-тромбина - протромби- ном и активируют его в среде, содержащей тканевый тромбопластин ионы кальция, плазму и сыворотку крови„