Способ выявления поверхностного антигена гепатита в Советский патент 1980 года по МПК A61B10/00 

( 54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА -ГЕПАТИТА В 1 . , ,, Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике заболеваний гепатитом В. Известен способ выявления поверхностного антигена гепатита В в йсслёдуемой пробе сыворотки или плазмы путем рпределеии я разности радиоактивности сыворотки, содержащей специфические меченые антитела, дО и после .ее контакта с фиксированным на инертном носителе антигеном гепатита В . Однако известный способ недостаточ но чувствителен, Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Эта цель достигается тем, что исследуемую пробу пропускают через ко-, лонку, заполненную анионообменным материалом- в форме частиц, которые находятся в равновесном состоянии в жид кости при рН 5-8, промывают колонку при рН 5-8, затем пропускают меченные радиоактивным изотопом специфические антитела с заранее определенным уровнем радиоактивности, инкубируют в те чение 0,5-18 ч при 4-50°С, затем колонку промывают при рН 5-8 и определяют радиоактивность анионообменного материала или элюата из предыдущей стадии. Предлагаемый способ используют для выявления поверхностного антигена гепатита В (НВ) в жидких пробах, таких как пробы сыворСтки или плазмы. В качестве адсорбентов для антигена гепа-тита используют различные гидрофобные матёриалы, включая некоторые алкштзамещенные полимеры, тайИе как to -агдиноалкилзамещенные агары, однако предпочтительно использовать ионообменные материалы. Значение рН для антигена НВ. находится в диапазоне 3,5-5, а для анти-НВ 8, предпочтительно рН равно 6-8, В качестве адсорбента используют анионоо менные вещества - диэтиламиноэтилзамещённые полимеры, в частности те, в которыхсодержатся полисахариды, например целлюлоза или декстран, в качестве основной цепи. В качестве адсорбента для антигена НВ можно использовать ДЕАЕ-целлюлозу, В качестве адсорбента можно использовать катионообменный материал, такой как карбоксйметилцеллюлозу, если значение рН меченого анти-НВ изменено до значения, которое ниже аналогичного показателя для антигена НВ, Для выявления антигена НВ в сыворотке или плазме пробу вводят в колонку, содержащую анионообменное вещест во в виде частиц, которые находится в равновесном состоянии в буферной жидкости с рН З-в, предпочтительно 6,5-7,5. Затем,ерез колонку пропуск ют буферную жидкость с рН 5-8, предпочтительно Б, 5-7,5, чтобы удалить полностью антиген HBg, который не ад сорбировался анионообменным вещест ном. . . После этого вводят в анионообменный материал заранее определенный объем раствора, меченного радиоизото пом анти-ЙВс,, имеющего определенный уровень радиоактивности. Выдерживают раствор, меченный -радиоиг1отопом анти-НВ, в контакте с днйонообменным.материалом 30 мич 18 ч, предпочтительно 1-3 ч при , предпочтительно 40-50 С. Пропускают через колонку буферную жидкость с рН 5-8, предпочтительно б,5-7, 5, чтобЕй удалить почти полностьюмеченный радиоизотопом анти-НВ который не сорбируется анионбобмен ньЕм вещёст;врм за ; счет связи с адсорбированным антигеном НВ5. /Измеряют радиоактивность анионорбмённого материала или. элюата предшествующей стадии; и сравнивают ра:диоактивнрсть, измеренную на предшествующей Стадии ; с р адиоактивность измеренной с использованием жидкой пробы, не .содержащей значительного колйчества анти1гена HBj, вместо сыворйт.ки или пЛаэглл,: , ; В качсестве буферных жидкостей используют фосфатный буфер,, барбитальный буфер, трио-(бксиметил)-амиломета новый буфер, 4-(2-оксиэтил -1-пипера ,зинэтанолсульфоновую кислоту (ГЭПЭС) и 1,4-пйперазин-бис-зтансульфоновую кислоту (ПИПЭС). Приме р 1. Подготовка аналиФической колонки. Койонки содержат 0,5 мп анионообменной смолы, ДЭАЭ-целлюлозы типа DE-52, которую загружают в колонку размером 9,5 х 75 мм, изготовленную из полиэтилена, между двумя пористым полиэтиленоёыми дисками. Колонку плрт:но закупоривают верхним колпаком и нижйей .крышкой .после того, как она заполнена объемс л 0,02М раствора сме си моноосновного фосфата натрия-двух ocHOBHOfd фосфата натрия, который вы полняет функц1ии буфера при рЙ 6,8. Буферного раствора должно быть доста точно,: чтобы произошло, насыщение смо лы и, кроме того, чтобы в резервуаре был слой в 1 .над уровнем смолы. Методика анализа.. Снимают верхний колпак и колонку укрепляют на решетке со стоком. В буфер, находящийся в резервуаре выше слоя ДЭАЭ-целлюлозной смоЯн, Д0 бавляют 200 мкл анализируемой пробы сйвбро ки или плазмы или отрицатель ного контрольного образца. Далее Содержимое колонны перемешивают, чтобы переминать.образец ;и буфер, а затем смесь стекает при снятии нижнего колпака. Слой смолы промывают двумя последовательными добавлениями 4 мл. 0,02 М раствора фосфатного буфера (рН 6,8). Когда жидкость из колонки полностью вытекает, сверху на слой смолы добав-. ляют 200 мкл З-анти-HBs (удельная активность меченого анти-НВ - 14 20 мкКи/мкг суммарная активность приблизительно 50.000 имп/1 1ин) . Радиоактивный препарат пропитывает сьлолу, после чего нижний колпак йнова закрывают (анти-НВ,,, который используется вместе с антитенЬм НВ, очищают в соответ ствии со способом Линга и Оверби и метят по Методу хлорамина Т). Затем колонку инкубируют 2 ч при 45°С (анализ 2 ч 45 С) либо в течение ночи при комнатной температуре 22°С. Затем нижнюю крышку снимают и слой смолы промывают двумя последовательными добавлениями 4 мл 0,02 М фосфатного буферного раствора (рН 6,8). Когда жидкость из колонки удаляется полностью, нижнюю крышку ставят на место и колонку помещают s гнездо счетчика гамма-излучения, такого, как счетчик dammacord, при этом определяют радиоактивнбсть слоя смолы. . Проба считается положительной, если дает уровень радиоактивности, источником которой является слой смолы, прев1аЕиающий (или дает уровень радиоактивности промывающей жидкости менее, чем) граничное значение, вычисляемое как среднее количество импульсов/мин гамма-излучения, источником которого является слой смолы. Ниже приведен пример вычисления граничного гамма-излучения (имп/мин) для. слоя смолы. Семь аналогичных отрицательных контрольных проб подвергают отдельно анашиЗУ и определяется количество (имп/мин) гамма-излучения, источником которого является слой СМО-. лы (пороговое значение имп/мин) для каждого образца. Образец Пороговое значение, имп/мин 10206 Общее 1 4 58 Среднее . Стандартное + 54 . . отклонение 1458 + (4 X Граничное X 54) 1678 значение

Следовательно, если подвергаемая анализу проба дает пороговое значение, превышающее 1678 имп/мин, то проба считается положительной на антиген HBg .

Пример 2. Радиоиммунносорбционный анализ на поверхностный антиген Гепатита В в форме его иммунного комплекса с антителом.

Описывается методика обнаружения антигена НВс,, присутствующего в пробе в комплексе в анти-НВ г т. е, в форме его иммунного комплекса.. В соответсТВИИ с предлагаемым способом можно производить анализ пробы сыворотки на антиген НВе, содержащей анти-НВ, а также производить анализ на антиген HBg в форме его иммунного комплекса в соответствующих пробах.

Колонки подготавливайт к анализам в соответствии с примером 1.

Методика анализа. Нижняя крышка закрыта, а верхняя снята: из резервуара сливают фосфатный буферный раствор, а на его место згшивают 1 мп бм

р аствора к арбамида в О,О2М фосфатном буферном растворе {рН 6,8).

В резервуар, содержащий смесь карбамид-буфер добавляют 200 мкл анализируемой пробы сыворотки или плазмы или 5 отрицательной контрольной пробы. Содержимое колонки перемешивают, чтобы смешать образец и смесь буфер-карбамид, а затем ему дают возможность отстояться в течение 10 мни перед тем, как расгтвор слить, что осуществляется

0 при снятии нижней крышки.,

После того как раствор сливается, повторяются стадии, описанные в примере 1.

Обнаружение антигена HBj, в сыворот5ке (эндогенным анти-HBg). Отрицательную контрольную сыворотку и обьачную коммерческую сыворотку, содержащую низкие концентрации антигена НВ и анти-НВс, подвергают анализу при помощи модифицированной методики со ста:дией инкубации 2ч 45°С, методики

Qusria которая списана в предыдущем примере, и методики Ousab фирмы Лабораториз Эбботт, Северный Чикаго. 5 Результаты приведены в таблице.

.4,0 3,0 2,0 1,0 0,4 0,2 . 0,0

Пороговое значение (имп/мин) для пробы минус граничное значение. Предлагаемый пример показывает, что можно обнаружить антиген ЯЪ в присутствии эндогенного анти-НВ,.. Чтобы, подтвердить присутствие антигена НВ, в сыворотке, проводится ис .следование на центрифуге. Пробу сыворотки, уравновешенную буферным pactвором глицина (рН 2,0) , обрабатывают сахарозным градиентом 5-20% (вес/вес) Смесь подвергают разделению на центрифуге со скоростью ЗбООО об/мин 3 Ч Фракции, которые извлекают из нижней части пробирки, при исследовании .по методике Qusria j на антиген VB были определены как положительные. Это подтверждает н.аличие антигена НВ в сыворотке и. ясно доказывает, что антиген HBs после отделения от анти-НВ, на центрифуге обнаруживается по методике Qusria -j в то время, как он не был обнаружен при помощи той же методики, когда находился в комплексе с анти-НВ. Обнаружение антигена НВс, в форме его иммунного комплекса. Приготавливают ряд проб для анализа добавлением возрастающих объемов положительной сыворотки антигена ЯВ к постоянному объему анти-НВд сыворотки человека с высоким титром. Окончательные объемы уравнивают нормальной сывороткой, отрицательной как на антиген НВ, так и на анти-fra После инкубации в течение 20 ч образо вавшийся осадок удаляют на центрифуге а образовавшийся верхний слой испольэуют в качестве анапи-зируемой пробы. Каждая получ€;нная таким образом проба анализируется по методике РИ-Ad, причем инкубацию осуществляют в течение 2 ч при 45°С, по методике Qusria-j-jr & также по методике Ousab. Результа;ты приведены в таблице. Ад/Ав означает отношение объема положительной на антиген йВв, сыворотки, добавляемой к обтьейу положительной на анти-НВ сы воротки ,. . По модифицированной методике РИ-Ad антиген ЙВ o6Hapy5)(:fl(feaeTCfl ErtIl5 cyTCT вйи анти-HBg при самой низкойТй&йЦёнтраЦии добавл мого антигена НВ (отношение Ад/Ав - 0,2). . В пробах, в которых анти-НВ присутствует в избытке (Ад/Ав 0,4)Тпо методике Ousr.ia33 не удается обмаружить присутствие антигена НВ. С другой cfqpoHB, наличие анти-НВ подтверждается в пробах, имеющих отношения Лд/Ав меньшие или равное 1,0 по методике Qusab Ьднакб tio мётЪда1йё dusab не удается обнаружить анти-НВе, в присутс-гвии избытка антигена НВл (Ад/Ав 2,а). П р им е р 3. Исследование адсорбционных свойств различных анионрi обменных веществ. для антигена НВ. В диапазоне рН 5-8 исследоваласЪ способность адсорбировать антиген НВ следующих анионообменных веществ: Д5АЭ-целлюлозс. тип ДЕ-52, ДЭАЭ-Зерbadex,;QAS-Sephadex i ДЭАЭ-В1од егС, Объем 200 мл З-НВ антигена (25 мг/мп) добавляют в каждую ййнескольких колонок,. Ьодержадах различные анионообмёниыё вбщёства npvi различных известных значениях рН. Далее каждую колонку промывают двумя объема.мц по 4 мл фосфатного буфера с соС)Тветствующими значения1ми рН. Затем рп)ределяют радиоактд1вность колонок ;при; помЬщи счетчика гамма-излучения. Г -/.,.:, Для каждой из исследованных смол : оптимальная адсорбция наблюдалась пр аначенйях 6,0-6,5. ДЭАЭ-цёллюлоза ДЭАЭ-Sephadex и QAE-Sephadex ИЙШТ весьма, сходное максимальное с зёдство адс6рб|ции к антигену-НВ, тогда как ДЭАЭ-Biogeft А проявляет несколько бо лее низкую способность к адсорбции а тигена. При белее широком исследовании было установлено, чтр ДЭАЭ-целлйлоза является предпочтительной смо лой.дПя применения в колонках,, так как не Создает энaчитeльWPr Pcoпpoти лёнИя потоку через колонку и обладае у|} нимальной тенденцией адсорбировать -анти-рВд. Пример 4, Радиоиммунносорбционный анализ (РИ-Ad) на поверхностный антиген гепатита В , Описывается методика РИ-Ad для об наружения антигена НВ, отличающаяся тем, что стадия пррмывки между стадией загрузки пробы и стадией добавления меченого анти-HBg, исключена. Каждый образец анализируют по методике PH-Ad -2 ч с использованием другой серии J-анти-НВе,. Пример 5. Использование гидрофобных адсорбентов в радиоиммунносорбционном (РИ-Ad) анализа на поверхностный антиген гепатита В. Исследуют ряд t -aмин.oaлкилзамещенных агароз в качестве адсорбентов в соответствии с методикой PH-Ad. Подготовка колонок и методика выполнения анализа описаны в примере Г, за исключением того, что адсорбент ДЭАЭ-целлюлозу заменяют различными 6i-аминоалкнлзамещенными агарами, а адсорбент 1тррмыватот двумя последовательными добавлениями 2 МП ciiiecH трис-оксимётиламиномеТан-хлоргидратный буфер и О,5М раствора хлорида натрия (рН 8,2). Две пробы сыВорогтки, одна отрицательная и одна прложительная на антиген НВс,, анализируют Сиспользованием ряда колРнок, причем каждая содержит Рдно из следующих веществ, имеющих общую формулу . arai)OB-(CH2)f, -NHg,, где п - 4-10 число атомов углерода в алкильной боковой цепи . Ы-АйинРалТс1йглзамещенные агарозы имеющие алкильные боковые цепи, содержащие более четырех атомов углерода, более прёдпРчтительнь для выявления ...антигена НВ. Пример 6. Колонки подготавливают к анализу в соответствии с методикой примера li . Снимают верхний колпак и колонку пРмещают на дренажную решетку. В буферный раствор, находящийся в рёз.ервуаре над слоем ДЭАЭ-целлюлозы, . добавляют 200 мл положительной сыворотки на антйген-НВс,. Содержимое колонки, перемешивают, чтРбы смешать образец и буфер, затем содержимое колонки Сливают при снятии нижней крышки..- . TlocJieтогокак содержимое колонки сливак1Т, слой Смолы промывают двумя последовательными порциями по 4 мл 0,02М раствора фосфатного буфера (рН 6,8). Далее на верхний диск наносят слой 200 мл- анализируемой пробы или отрицатеЛьнрго кРнтрольного образца, которому дают Возможность впитаться в слой смолы. Нижиюю крьЕику устанавливают на место и колонку инкубируют 2 ч при 45°с. Нижнюю крышку вновь снимают и сверху. на СЛОЙ смолы наносят слой 2000 мл

/ Э-анти-ВВ, и ему дают возможность впитаться в слой смолы. Нижнюн крьоику снова за срывают и колонку инкубируют еще 2 ч при 45°С.

Нижнюю крышку снова снимают и слой смолы промывают двумя последовательными пйрциями по 4 мл 0,02М раствора фосфатного буфера (рй 6,8),

Когда содержимое колонки полностью стечет, нижнюю крылку вновь закрывают и измеряют радиоактивность колонки при гюмощи сче Т4ика гамыа-излучения. ; Предлагаемый способ является более чувстйительным и позволяет быстро и точно выявить поверхнрстн1Ый антиген гепатита В в исследуемой пробе.

Формула изобретения

Способ выявления поверхностного антигена гепатита б в исследуемой пробе сыворотки крови или плазм путем определения разности радиоактивности сыворотки, содержащей специфические меченые антитела, до и. после ее контакта, с фиксированным на инертном носителе антигеном гепатита В, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, исследуемую пробу пропускают через колонку, заполненную анионообменным материалом в форме частиц, которые находятся в равновесном состоянии в жидкости при рН .5-8, промывают колонку при рН 5-8, затем пропускают меченные радио0активным изотопом специфические антитела с заранее определенным уровнем радиоактивности, инкубируют в теченце 0,5-18 ч при 4-50 С, затем колонку промывают при рН 5-8 и определяют радиоактивность анионообменного материала или элюата из предыдущей стадии.

Источники информации, 0принятые во внимание при экспертизе.

1. Патент США 3938853, кл. 308-4, опублик. 1976.