Способ получения претромбина 1 Советский патент 1982 года по МПК A61K35/16 

(S) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕТРОМБИНА 1

Изобретение относится к медицине и быть применено для диагностики состояния противосвертывапщей системы, а таюхе для активации ее функции с целью профилактики заболеваний сердечно-сосудистой и других систем, осло хненных тромботйческими явлениями.

Известен способ получения претромбина 1 путем осаждения протромбиноврго комплекса из крови, гидролиза его тромбином с последующей хроматографической очисткой гидролизатаЩ

Однако известный способ обеспечивает низкий выход целевого продукта 20-25%j и, кроме того, способ длителен и трудоемок ( требует 29-33 ч и не позволяет получить высокоочищенный продукт.

Цель изобретения - увеличение выхода и чистоты целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения претромбина 1 путем осаждения протромбинового комплекса из плазмы крови, гидролиза его тромбином,, с последующей хроматографической очисткой гидролизата, гидролиз протромбинового комплекса осуществляют в среде, содержащей этилендиаминтетраацетат натрия и трис-буфер, хроматографическую очист10ку гидролизата осуществляют на сорбенте гепарин-сёфароза и элюируют целевой продукт в линейном градиенте хлорида натрия с концентрацией 0,05-1,5 М в трис-ацетатном буфере при рН 6,06,2 и концентрации хлорида кальция 2,-2,6 ммоль.

Пример 1. Протромбиновый комплекс получают осаждением его из

20 плазгш быка на цитрате бария, последующей элюцией, фракционированием сульфатом аммония и изозлектрическим осаждением. 3 . 9 Берут 20 мг протромбинового конплекса ( 2000 NIH ед. на 1 мг белка) и инкубируют с 30IV/ 1Н ед. тромбина (2000N1H ед. на 1 мг белка; в 0,05 М Трис-НС буфере, рН 7,, содержащем 1 ммоль ЭДТЛ-натриевой соли 15 мин при (соотношение фермента и субстрата по единицам активности 1:1300/. Реакционную смесь диализуют против 0,02 М трис-ацетатного буфера рН 6,0, содержащего 0,05 М NaCI 15 ч Затем в диализат добавляют 0, М раст вор r.aCI до конечной концентрации 2,5 ммоль и наносят в объеме 6 мл на колонку с гепарингсефарозой. (1х40 см) уравновешенную 0,02 ммоль трис-ацетат ным буфером, рН 6,0, содержащим 0,05 М NlaCI и 2,5 ммоль CaCI. Пер|вую элюцию проводят тем же буфером в объеме 60 мл. Затем проводят градиентную элюцию, используя для создания линейного градиента ионной силы следующие растворы: 100 мл 0,02 М трис-ацетатного бубера, рН 6,0, содер жащего 0,05 М МаС1 и 2,5 мН СаС1 и 100 мл того же бусйера, содержащего 1,5 М NaCI. В ;элюируемых фракциях анализируют содержание белка и свертывающую активность. Со свободным объе/юм колонки выходят несвязавшиеся белки ( 20 ), среди которых обнаруживают фрагмент 1 протромбина с молекулярной .массой 25000, отщепляемый от молекулы протромбина тромбином в процессе гидролиза. Градиентной элюцией получают три белковых компонента. Первый компонент, содержащий 70 нанесенного белка, элюируется 0,45 М SlaCI. Молекулярная масса компонента определена равной бОООО. Компонент идентифицирован как претромбин 1. При концентрации NaCI О,.64 М элюируют второй компонент, содержащий 5 нанесенного белка с молекулярной массой 50000, не проявляющий характерных ...-- ,. 1 . .. .. свойств претромбина 1 и тромбина и идентифицированный как фактор X. При увеличении концентрации NaCI до 0,9 М элюируется третий компонент, содержа;ИЙ следовые количества тромбина 0,1 W1H ед. на 1 мл элюата/. Из 20 мг тромбинового гидролизата протромбина получают 14 мг претромбина 1, гомогенного при электрофореза б геле полиакриламида, с молекуля ной массой 60000, не обладающего фибриноген-свертывающей, эстеразной, фиб ринолитической и протромбиновой ак294тивностями. Претромбин 1 медленно (в течение часа генерирует тромбин . -. ( ед/мг в присутствии фактора j/2 ед/мгЛ Полученные препарыты претромбина 1 проявляют высокую физиологическую активность, возбуждая функциюпротивосвертывающей системы при внутривенном введении крысам в концентрации 0,5 мг/кг веса тела. В табл. 1 показано изменение биохиммческих .показателей состояния противосвертывающей системы после внутривенного введения претромбина 1 (0,5 мг/кг веса; . Таким образом, претромбин 1, введенный внутривенно крысам в концентрации 0,5..мг/кг веса, уже на 1-ой мин опыта вызывает статистически достоверное увеличение суммарной фибринолитической активности ( СФЛ) на Зб% и неферментативного фибринолиза ( НФJ, отражающего уровень комплексных соединений гепарина с белками крови и биогенными аминами, на 41. Выброс гепарина в кровоток является важнейй|им этапом эффекторной реакции противосвертывающей системы. Таким образом претромбин 1, при внутривенном введении kpыcaм в низкой дозе 0,5 мг/кг веса активирует функцию противосвертывающей системы, что говорит о хорошем качестве препарата. Пример 2. Протромбиновый комплекс получают как в примере 1. Затем берут Г протромбинового комплекса С ПООО N1H ед. .на 1 мг белка) и инкубируют с 30 N1H ед. (2000 N1H ед. на 1 Мг белка) тромбина в 0,05 М трисYICI буфере, рН 7,4, содержащем , 1 даль ЭДТА-натриевой соли, 20 мин при 37°С, Соотношение фермента и субстрата по единицам активности 1:2000. Последующие операции проводят как в примере 1. Получают 21 мг претромби гомогенного при электрофорезе в геле полиакриламида, с молекулярной массой 63000, не обладающего йибриноген-свертывающей, эстеразной (по ТАМЭ и БАМЭ), фибринолитической и протромбинопой активностью. Претромбин 1 генерирует тромбин ( ед„/мг; в течение часа в присутствии фактора XQJ (2 ед./мг. Препарат претромбина 1 проявляет высокую физиологическую активность при анализе методом перфузии гуморально изолированного, но с сохраненными нервными связями с организмом каротидного синуса кролика. В табл. 2 показано изменение биохимичес59

ких показателей состояния противосвертывающей системы после перфузии каротндного син«са кролика претромбином 1 (0,07мг/мл в объеме 20 мл).

Таким образом/при перфузии пре.тромбином 1, полученным-в примере 2. изолированного каротидного синуса , . кролика происходит активация противосвертываощей системы, характеризующаяся статистически достоверным увелишением к мин опыта времени рекальцификации плазмы на 31% суммарной фибринолитической активности на 36%, неферментативного фибринолиза - на . Высокий антикоагулянтны фон, создаваемый комплексйыми соединениями гепарина, сохраняется на 10-ой мин опыта.

Изложенные данные свидетельствуют о том, что претромбин 1, взаимодей136,2±10,7 (6)

MiM/yi/

со,01

Р 3k,6±},2 (6) М±п/и/

0,02

Р

296

ствуя с хеморецепторами только одной из рецепторных зон противосвертывающей системы, в очень малых концентрациях (О,07 мг/мл) вызывает рефлекторный ответ этой системы, создающий высокий антикоагулянтный и фибринолиТический фон и предотвращающий угрозу тромбообразования при провокации тромбиногенеза.

Предлагаемый спосоо позволяет по,лучить целевой продукт за 10-12 ч против ч известным способом. Выход претромбина составляет 65-75% по сравнению-с известным 20-251. Претромбин 1, полученный предлагаемым способом, свободен от примеси диизопропилфторфосфат-тромбина, который обладает физиологической активно cтью.

Таблица 1

Таблица 2

131,2t5,8 (6) 0,001

132,01: 9,0 (6) 0,01

раствором Рингера-Локка.

Формула изобретения

Способ получения претромбина 1 путем осаждёНйя протромбинового комплек са из Илйэмы крови, гидролиза его тромбином с последующей хроматографической очисткой гидролизата, о т ii и ч а ю с я тем, что, с целью увеличения выхода и чистоты целевого продукта, гидролиз протромбинового комплекса осуществляют в среде содержащей этилендиаминтетраацетат натрия и трис-б1а0ер, хроматогра8

Продолжение табл. 2

фическую очистку гидролизата осуществляют на сорбенте гепарин-сёфароза И элйируют целевой продукт а линейном градиенте хлорида натрия с концентрацией 0,05-1,5 М в трис-ацетатном буфере при рН 6,0-6,2 и концентрации хлорида кальция 2,4-2,6 ммоль.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1, Heldebrant С.Н., Butkowsk R.I. Bajaj S.P., Mann K.G. The activation of prothrombln. - I. Biol. Chem., 1973, V. 2W, p. 71A9-7163.