уравновешенную 0,09-0,10 М раствором уксуснокислого аммония, рН 7,8-8,0. Часть белка проходит анионит, а активатор протеина С связывается с DEAE-целлюлоэой при рН 7,8-880, и его элюируют линейным градиентом ионной силы раствора уксуснокислого аммония от 0,09-0,10 до 0,90-1,00 М (рН 7,8-8,0). Фракции активатора протеина С собирают и высушивают при помощи лиофилизации дважды.
Выход целевого продукта по белку 1,5%. Удельная активность активатора протеина С 1500 ед/мг.
За единицу активности активатора протеина С принимают количество препарата, которое за 1 мин при 37°С и рН 8,0 активирует 1 мкмсгль протеина С.
В исходном материале, в ядре щитомордника, невозможно количественно определить активность активатора протеина С, так как яд содержит активные протеиназы, которые интенсивно гидролизуют субстрат,, активированного протеина С. Поэтому невозможно рассчитать степень очистки препарата активатора протеина С и его выход По активности.
Полученный согласно способу препарат активатора протеина С из яда щитомордника активирует протеин С, о чем судят по быстрому появлению эстеразной и амядазной активности протеина С и по удлинению времени свертывания плазмы крови после добавления в нее активированного протеина С. Инкубация активатора с плазмой крови также приводит к удлинению тромбопластинового времени плазмы. Эффект пропорционален времени инкубации смеси до инициации свертывания.
Препарат активатора не свертывает 0,3%-ный раствор фибриногена, не обладает тромбиноподобной (активатор- ной) активностью по отношению к факторам V и VIII и не инактивирует их, не обладает фактор Х-подобной активностью по отношению к 0,01%-ному раствору протромбина, не активирует плазминоген и не обладает фибрино- литической (плазменно-подобной) активностью. Таким образом, препарат является селективным и эффективным активатором протеина С, так как не активирует другие белки при их физиологической концентрации.
Препарат можно использовать в качестве экзогенного активатора протеина С в определении его функцио- нальной активности в крови.
Пример 1. К 1,0 г яда щитомордника добавляют 5 мл 0,19 М раствора уксуснокислого аммония, смесь медленно перемешивают в течение 4 ч
при 4 С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4° С в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, над- осадочную жидкость используют для гель-фильтрации. Гель-фильтрацию проводят на колонке сефадекса G-100
тонкий, размеры колонки 3,0 150 см. Колонку элюируют 0,19 М раствором уксуснокислого аммония со скоростью 30 мл/ч и собирают фракции по 15 мл.
Q Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Уви- корд-11. Получают три белковых пика. В первом пике фракции, которые имеют актцвность активатора протеи-
5 на С, объединяют, разбавляют в два раза бидистиллированной водой и устанавливают рН 7,8. Раствор активатора наносят на уравновешенную 0,09 М раствором уксуснокислого аммония при рН 7,8 колонку DEAE-целлюлозы (2,4х 25 см) и элюируют со скоростью 35 мл/ч до равновесия 0,09 М раствором уксуснокислого аммония при рН 7,8. Затем элюируют колонку линейным градиентом ионной силы раствора (550+550 мл) уксуснокислого аммония от 0,09 до 0,90 М при рН 7,8. Фракции по 15 мл, содержащие активатор протеина С, объединяют (150 мл) и лиофилизируют дважды.
Выход 16,2 мг (1,62% по белку). Удельная активность активатора 1590 ед/мг.
Пример 2. К 1,0 г яда щитомордника добавляют 5 мл 0,20 М раствора уксуснокислого аммония, перемешивают в течение 4 ч при 4°С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4°С в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гель-фильтрации на колонке (30 150 см) сефадекса G-100. Колонку элюируют 0,20 М раствором уксуснокислого аммония со скоростью 30 мл/ч и собирают фракции
5 по 15 мл. В первом лике Аракции, которые имеют активность активатора протеина С, объединяют, разбавляют в два раза водой и устанавливают
0
5
0
5
0
рН 7,9. Раствор активатора наносят на уравновешенную 0,10 М раствором уксуснокислого аммония при рН 7,9, колонку DEAE-целлюяозы и элюируют до равновесия этим же раствором. За- тем элюируют колонку линейным градиентом ионной силы раствора (550 + + 550 мл) уксуснокислого аммония от 0,10 до 0,95 М при рН 7,9. Фракции по 15 мл, содержащие активатор протеина С, объединяют (150 мл) и лиофи лизируют дважды.
Выход 16,4 мг (1,64% по белку). Удельная активность активатора 1575 ед/мг.
Пример 3. К 1,0 г яда щитомордника добавляют 5 мл 0,21 М раствора уксуснокислого аммония, перемешивают в течение 4 ч при 4°С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4°С в течение JU мин Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гель-фильтрации на сефадексе G-100. Колонку элюируют 0,21 М раствором уксуснокислого аммония со скоростью 30 мл/ч и собирают фракции по 15 мл. В первом пике фракции, которые имеют активность активатора протеина С, объединяют, разбавляют в два раза водой и устанавливают рН 8,0. Раствор активатора наносят на уравновешенную 0,10 М раствором уксуснокислого аммония при рН 8,0 колонку DEAE-целлю- лозы до равновесия этим же раствором Затем элюируют колонку линейным гра0
5
0
5
0
5
диентом ионной силы раствора (550 + + 550 мл) уксуснокислого аммония от 0,10 до 1,00 М при рН 8,0. Фракции по 15 мл, содержащие активатор протеина С, объединяют (150 мл)-и лнофи- лизируют дважды.
Выход 15,7 мг (1,57% по белку). Удельная активность активатора 1640 ед/мг.
Формула изобретения
Способ получения экзогенного активатора протеина С, включающий растворение змеиного яда в буферном растворе, очистку полученного раствора колоночной хроматографией и лио- фнльное высушивание очищенного раствора, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, в качестве змеяного яда используют яд щитомордника, растворение ведут в буферном растворе ацетата аммония с концентрацией 0,19-0,21 М, очистку проводят на сефадексе G-100 и после этого фракции, содержащие активатор протеина С, смешивают с водой в соотношении 1:1, устанавливают рН 7,8- 8,0, подвергают очистке колоночной хроматографией на ЛЭАЭ-иеллюлозе, элюируя продукт градиентом концентрации ацетата аммония от 0,09-0,10 до 0,90-1,0 М при рН 7,8-8,0 с последующим двукратным лнофильным высушиванием.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБИНОПОДОБНЫХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ЯДА ЗМЕИ | 2004 |
|
RU2271219C1 |
| Способ выделения оксидазы @ -аминокислот из яда гюрзы | 1982 |
|
SU1055769A1 |
| Способ выделения фактора роста нервной ткани из змеиного яда | 1982 |
|
SU1055732A1 |
| Способ получения фосфодиэстеразы | 1980 |
|
SU942759A1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВАТОРА ПРОТЕИНА С | 2000 |
|
RU2184976C1 |
| Способ выделения фосфолипазы А2 из яда кобры | 1984 |
|
SU1188948A1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ СУБСТАНЦИИ | 2011 |
|
RU2448156C1 |
| Способ получения нуклеазы | 1981 |
|
SU998502A1 |
| Способ получения нуклеазы @ | 1983 |
|
SU1161550A1 |
| ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM ESTINOGENUM A.KOMATSU ET S. ABE EX G. SM. - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ P И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ | 2002 |
|
RU2220198C1 |
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения активатора протеина С из яда щитомордника, способного к превращению протеина С плазмы крови в активную форму, протеин CA. Целью изобретения является упрощение способа и повышение выхода целевого продукта. Способ заключается в следующем: яд щитомордника растворяют в растворе 0,19 - 0,21 М ацетата аммония и очищают методом гель-фильтрации на сефадексе G-100. Фракции, содержащие активатор протеина С, разбавляют в 2 раза водой и устанавливают PH 7,8 - 8,0. Раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,09-0,10 М ацетатом аммония с PH 7,8 - 8,0 и элюируют линейным градиентом ионной силы раствора ацетата аммония от 0,09 - 0,10 до 0,90 - 1,00 м, PH 7,8 - 8,0. Фракции активатора протеина С собирают и высушивают при помощи лиофилизации дважды. Выход целевого продукта по белку 1,5%, удельная активность 1500 ед/мг.
Редактор И.Дербак
Составитель А.Семенов Техред М.Дидык
Заказ 1199
Тираж 479
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35 Раушская наб., д. 4/5
Корректор Э.Лончакова
Подписное
