АНТИБИОТИК "ЭРЕМОМИЦИН" И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Советский патент 1997 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к биологически активным соединения, проявляющим антибактериальную активность, а именно к антибиотику эремомицину, который может быть применен в качестве лекарственного препарата в медицинской практике.

Предлагаемое соединение и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан.

Предлагаемое соединение антибиотик эремомицин относится к гликопептидной группе соединений.

Антибиотики этой группы обладают высокой антибактериальной активностью в отношении грамположительных бактерий и микобактерий. Преимуществом этой группы перед рядом антибиотиков других групп является бактерицидный тип действия и почти полное отсутствие привыкания к ним микроорганизмов в процессе лечения. Для них характерна также низкая токсичность. Поэтому изыскание новых препаратов этой группы, менее токсичных и более активных, перспективно.

Из числа соединений гликопептидной группы в настоящее время в медицинской практике применяется отечественный ристомицин, американский ванкомицин при лечении стафилококковых инфекций. Важным свойством этих антибиотиков является возможность их использования в тех случаях, когда возбудитель заболевания устойчив к широко распространенным антибиотикам, например пенициллинам.

Характерным отличительным признаком антибиотиков гликопептидной группы является аминокислотный состав. Предлагаемый антибиотик эремомицин ближе всего по аминокислотному составу к антибиотику ванкомицину: в его гидролизате содержится актиноидиновая кислота, аспарагиновая кислота и H-метил-D-лейцин, специфичные для гидролизата ванкомицина.

Однако антибиотик эремомицин отличается от ванкомицина по содержанию хрома в молекуле, величине удельного вращения, хроматографической подвижности в разных системах растворителей и электрофоретической подвижности.

Целью изобретения является создание нового антибиотика эремомицина, - обладающего антибактериальной активностью и расширяющего арсенал средств воздействия на патогенные бактерии.

Цель достигается микробиологическим синтезом нового химического соединения антибиотика эремомицина, обладающего антибактериальной активностью.

Антибиотик эремомицин имеет элементный состав, C 54,86; H 6,14; N 9,02; Cl 2,40 эквивалент по хлору 1479.

Оптическая активность [α]20D

-10,03 (C 1, вода).

Антибиотик имеет специфический УФ-спектр, характерный для соединений, содержащих фенольные гидроксилы. Максимум поглощения в УФ-спектре в воде при λ_макс282 нм/вода (E1%1см

-38,4) в щелочных растворах наблюдается батохромный сдвиг на 18 нм (λ_макс 300 нм). Максимальные частоты поглощения в ИК-спектре (КВr): ν_макс3400-3200 см^-1, которая является комплексной и может отвечать колебаниям и NH-связей аминных и амидных группировок, OH-спиртовых и фенольных гидроксилов, CH-связей ароматического ядра; поглощение 2900 см^-1 обусловлено CH-валентными колебаниями метильных групп и метиленовых групп; полоса 1670 см^-1 связана с карбонильным поглощением (амид I), полоса 1500 см^-1 (амид II); полоса 1200 1000 см^-1 связана с наличием углеводов (C O первичных, вторичных и третичных спиртов), а также с колебанием C N-связи аминных групп.

Антибиотик эремомицин однороден и содержит только одно биологически активное пятно.

Антибиотик эремомицин представляет собой амфотерное соединение, легко растворимое в водных растворах кислот и щелочей и практически нерастворимое в органических растворителях.

Антибиотик эремомицин легко кристаллизуется из воды, насыщенной этилацетатом, из водных растворов пропанола (80%) и этанола (50%). Из концентрированных водных растворов при слабо щелочной реакции среды (pH 7,5) антибиотик выпадает в виде основания.

Антибиотик эремомицин не имеет определенной температуры плавления, при температуре выше 250^oC он разлагается.

Антибиотик эремомицин дает положительные реакции на свободные аминогруппы (нингидриновую), углеводы (Молиша) и фенольные гидроксилы (Паули).

Для получения антибиотика эремомицина используют культуру продуцент Nocardia orientalis штамм 238, который был впервые выделен из почвы, и проводят глубинную ферментацию, в процессе которой эремомицин накапливается в культуральной жидкости. Культуру продуцент штамм 238 первоначально выращивают в колбах емкостью 750 мл, содержащих 150 мл питательной среды при 28^oC, на качалках 220 об/мин. Максимальное образование антибиотика наблюдается через 96 ч культивирования продуцента на среде следующего состава, соевая мука 1,5; глицерин 2; (NH₄)₂SO₄ 0,15; NaCl 0,2 и CaCO₃ 0,2.

Эремомицин выделяют из нативного раствора сорбцией на Амбердите ХАД-2 с последующей элюцией смесью ацетон н-бутанол вода (1:1:1), pH 3,0. Органические растворители отгоняют в вакууме и осаждают антибиотик из водного концентрата избытком ацетона. Очистку препарата сырца проводят на карбоксильной смоле КБ-2 в (NH+4

)- форме с коэффициентом набухания 5,9. На смолу антибиотик сорбируют из водного раствора при pH 6,5, элюируют 0,5 н. раствором NH₄OH. Активные элюаты объединяют, отгоняют аммиак в вакууме и осаждают антибиотик ацетоном. Кристаллизуют антибиотик из водного этанола.

Пример. Для получения спорового материала культуру Nocardia orientalis штамм 238 выращивают в течение 10 14 дней при 28^oC на среде следующего состава,
Крахмал 2
K₂HPO₄ 0,05
MgSO₄ 0,05
KNO₃ 0,1
NaCl 0,05
FeSO₄ 0,001 (следы)
Агар-агар 2
pH до стерилизации 7,2 7,4.

Посевной мицелий получают из спор культуры, засевая их в колбы Эрлеймейера емкостью 750 мл, содержащие 150 мл питательной среды следующего состава,
Бульон Хоттингера 3 (28 30 мг% аминного азота)
Пептон 0,5
Глюкоза 1,0
NaCl 0,5
CaCO₃ 0,2
pH до стерилизации 7,0 7,2.

Выращивают посевной материал в течение 48 ч при 28^oC в колбах на качалке 200 220 об/мин. Посевной материал вносят в ферментационные колбы из маточных колб в количестве 3 5% и ферментацию проводят на качалке при 28^oC. Для ферментации используют среду следующего состава, соевая мука 1,5; глицерин 2,0; (NH₄)₂SO₄ 0,15; NaCl 0,15; CaCO₃ 0,2; pH до стерилизации 7,2.

Антибиотическую активность определяют на пятые сутки ферментации. Она составляет в среднем 100 200 мкг/мл.

Нативный раствор объемом 5 л, pH которого 6,8 7,3, пропускают через колонку с 500 мл смолы Амберлит ХАД-2 при скорости 120 мл/см².ч.

По окончании сорбции колонку промывают дистиллированной водой (1 л) и промывные воды отбрасывают. Эремомицин элюируют со смолы смесью ацетон - н-бутанол вода в соотношении 1:1:1, предварительно подкисленной 18%-ной HCl до pH 3,0. Элюцию проводят со скоростью 1 мл/ч с 1 мл смолы и получают 500 мл элюата (активность элюата, определенная в отношении Staphylococcus aureus составляет 3000 единиц разведения/мл). Элюат упаривают в вакууме до полного освобождения от органических растворителей (бутанола и ацетона). Из водного остатка антибиотик осаждают четырьмя объемами ацетона. Осадок отфильтровывают и высушивают до постоянной массы в вакуум-эксикаторе. Полученный препарат-сырец в количестве 1 г растворяют в воде (концентрация 50 мг/мл, pH 6,5) и антибиотик сорбируют на колонке с карбоксильной смолой КБ-2 в (NH+4

)- форме из расчета 1 г сырца на 10 мл ( приблизительно 3 г) смолы. Элюцию проводят 0,5 н. NH₄OH. Активные элюаты объединяют, концентрируют в вакууме до 1/10 первоначального объема и осаждают основание антибиотика 10 - кратным объемом ацетона. Получают 500 мг аморфного порошка антибиотика с активностью 4000 единиц разведения/мг.

Очищенный антибиотик кристаллизуется в виде тонких игл из 50%-ного водного этанола (концентрация 50 мг/мл, pH 7,5), выход 60% Кристаллический препарат имеет максимум поглощения в воде λ_макс282 нм/вода, E1%1см

38,4 оптическое вращение [α]20D 10 (C 1, вода).

Найдено, C 54,86; H 6,14; N 9,02; Cl 2,40.

Эквивалент по хлору 1479.

Активность кристаллического препарата в отношении Staphylococcus aureus составляет 600 единиц разведения/мг.

Предложенный способ позволяет получить биологически активное соединение
антибактериальный антибиотик эремомицин.

Новый препарат антибиотик эремомицин gнесколько превосходит антибиотик ванкомицин по антибактериальной активности и химиотерапевтическим показателям.

По величине МПК (минимальная подавляющая концентрация), определенной in vitro в отношении одиннадцати различных видов микроорганизмов, эремомицин имеет преимущество перед ванкомицином. Из таблиц видно, что для подавления роста большинства грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов доза нового антибиотика меньше в 2 3 раза, чем доза ванкомицина (Staphylocоccus aureus 209P, Sarcina lutea, Bacillus subtilis 6633, Bacillus subtilis 759, Bacillus subtilis 762, Escherichia coli B, Escherichia coli K-13, Comamonas terrigena).

Химиотерапевтическую активность эремомицина изучают на модели стафилококкового сепсиса белых мышей. Результаты представлены в табл. 1.

Эремомицин также, как и антибиотик ванкомицин, обладает высокой эффективностью при лечении стафилококкового сепсиса белых мышей. Из табл. 1 видно, что показатели химиотерапевтической активности эремомицина несколько выше, чем у ванкомицина. Так величина ЕД₅₀ нового антибиотика в отношении стафилококка "Сазонов" почти в 2 раза меньше.

Изучение острой токсичности эремомицина и антибиотика ванкомицина при внутривенном введении проводят на белых мышах. Результаты даны в табл. 2.

Эремомицин обладает в два раза менее выраженной острой токсичностью, чем ванкомицин.

1. Антибиотик эремомицин имеет элементарный состав, %: C 54,86; H 6,14; N 9,02, Cl 2,40; эквивалент по хлору 1479 (α)20D

- 10,03 (С = 1, вода). Максимум поглощения в УФ-спектре в воде при λ_макс 282 нм/вода, E1%1см 38,4, максимум поглощения в щелочных растворах при λ_макс 30 нм/0,1 н. NaOH, максимальные частоты поглощения в ИК-спектре (КВr): ν_макс 34000 - 3200 см^- 1, которая является комплексной и может отвечать колебаниями NH-связей аминных и амидных группировок, ОН-спиртовых и фенольных гидроксилов, СН-связей, ароматического ядра, поглощение 2900 см^- 1 обусловлено С-Н валентными колебаниями метильных и метиленовых групп, полоса 1670 см^- 1 связана с карбонильным поглощением (амид I), полоса 1500 см^- 1 (амид II); полоса 1200 - 1000 см^- 1 связана с наличием углеводов (С-О первичных, вторичных и третичных спиртов), а также с колебанием C-N-связи аминных групп. Амфотерное соединение, легко растворимо в водных растворах кислот и щелочей и нерастворимо в органических растворителях, легко кристаллизуется из воды, насыщенной этилацетатом, из водных растворов пропанола (80%) и этанола (50%), из концентрированных водных растворов при слабощелочной реакции выпадает в виде основания. Определенной температуры плавления не имеет, при температуре выше 250^oС разлагается. Дает положительные реакции на свободные аминогруппы (нингидриновую), углеводы (Молиша) и фенольные гидроксилы (Паули).

2. Способ получения антибиотика эремомицина, заключающийся в том, что культуру - продуцент Nocardia orientalis штамм ИНА 238 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, органические и неорганические источники азота и минеральные соли, далее полученный нативный раствор собирают на смоле Амберлит ХАД-2 и целевой продукт элюируют смесью ацетон - н-бутанол - вода, взятых в соотношении 1 : 1 : 1, при рН 3,0 ± 0,5, затем осаждают из водного концентрата избытком ацетона и очищают хроматографически при рН 6,5 ± 0,1 на карбоксильной смоле КБ-2 в (NH+4

) форме 0,5 н.раствором аммиака, далее осаждают антибиотик ацетоном и кристаллизуют из водного этанола.

1. Антибиотик эремомицин имеет элементарный состав, C 54,86; H 6,14; N 9,02, Cl 2,40; эквивалент по хлору 1479 ((α)20D

10,03 (С 1, вода). Максимум поглощения в УФ-спектре в воде при λ_макс 282 нм/вода, E1%1см 38,4, максимум поглощения в щелочных растворах при λ_макс 30 нм/0,1 нр NaOH, максимальные частоты поглощения в ИК-спектре (КВr): ν_макс 34000 3200 см^- 1, которая является комплексной и может отвечать колебаниям NH-связей аминных и амидных группировок, ОН-спиртовых и фенольных гидроксилов, СН-связей, ароматического ядра, поглощение 2900 см^- 1 обусловлено С-Н валентными колебаниями метильных и метиленовых групп, полоса 1670 см^- 1 связана с карбонильным поглощением (амид I), полоса 1500 см^- 1 (амид II); полоса 1200 1000 см^- 1 связана с наличием углеводов (С-О первичных, вторичных и третичных спиртов), а также с колебанием C-N-связи аминных групп. Амфотерное соединение, легко растворимо в водных растворах кислот и щелочей и не растворимо в органических растворителях, легко кристаллизуется из воды, насыщенной этилацетатом, из водных растворов пропанола (80%) и этанола (50%), из концентрированных водных растворов при слабо щелочной реакции выпадает в виде основания. Определенной температуры плавления не имеет, при температуре выше 250^oС разлагается. Дает положительные реакции на свободные аминогруппы (нингидриновую), углеводы (Молиша) и фенольные гидроксилы (Паули). 2. Способ получения антибиотика эремомицина, заключающийся в том, что культуру продуцент Nocardia orientalis штамма ИНА 238 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, органические и неорганические источники азота и минеральные соли, далее полученный нативный раствор собирают на смоле Амберлит ХАД-2 и целевой продукт элюируют смесью ацетон н-бутанол вода, взятых в соотношении 1 1 1 при рН 3,0 ± 0,5, затем осаждают из водного концентрата избытком ацетона и очищают хроматографически при рН 6,5 ± 0,1 на карбоксильной смоле КБ-2 (NH+4) 0,5 н.раствором аммиака, далее осаждают антибиотик ацетоном и кристаллизуют из водного этанола.