Способ определения повреждающего воздействия химических веществ на клетки IN VIтRо Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биологии, в частности к определению токсических веществ,

Цель изобретения - повышение чувствительности способа за счет измерения уровня АТФ в лимфоцитах, инкубированных с разобщителем окислительного фосфорилирования и без него.

На фиг.1 представлена электронная схема устройства хемилюминометра; на

фиг.2 представлена конструкция устройства хемилюминометра.

Схема состоит из фотоэлектронного умножителя ФЭУ-84-3, операционного усилителя на одной микросхеме (К544 УД 1Б) и внешних источников питания. Для питания микросхемы применяют источники питания В при токе потребления 3-4 мА. Для питания ФЭУ используют стабипи юнанный высоковолътный источник питания на 1000-1200 В при токе потребления 0,6 мА. В качестве регистратора применяют стрелочный микроамперметр или самопишущий потенциометр«,

Устройство (фиг о2) содержит измерительную кювету 1, держатель кюветы 2 со съемкой конической крышкой 3, обеспечивающей быстрый доступ к кювете и светоизоляцию, внутренний корпус 4, в котором размещены фотоэлектронный умножитель с динодным делителем 5 и операционный усилитель 6, и внешний корпус 7.

Дно измерительной кюветы приближено к фотокатоду ФЭУ, что обеспечивает большой угол светосбора (около 100). Кежду дном измерительной кюIV.После инкубации клеток в течение 2 мин добавляют разобщитель окислительного фосфорилирования и

г продолжают инкубацию еще 2 мин. Эту пробу повторяют, ступенчато увеличивая концентрацию разобщителя до тех пор, пока не начнется отчетливое снижение концентрации АТФ. Подобранную

JO таким образом концентрацию разобщителя используют при измерении по п. V, а соответствующую концентрацию АТФ - при расчетах.

V.После инкубации клеток в те- 15 чение 2 мин с исследуемым веществом

добавляют разобщитель (в концентрации, подобранной, как описано в 1 п. IV) и продолжают инкубацию еще 2 мин Вещества относят к биологически

веты и фотокатодом ФЭУ установлен фо- 20 активным (которые включают и потенцитоэатвор 8, в который вмонтирован держатель кюветы„ Фотозатвор необходим для защиты фотокатода ФЭУ от внешнего света при снятии крышки кю- ветодержателя для внесения добавок в кювету.

Пример 1 о Лимфоциты выделяются из тимуса крысы стандартным способом. Лимфоциты (108 кл/мл) инкубируют в ячейке из оргстекла рабо- чим объемом 0,5 мл при постоянном перемешивании с помощью запаянной в стекло магнитной мешалки при 37° в , среде инкубации, которая содержит 145 мМ NaCl; 5,6 мК КС1; 2 мМ NaH2PO 8 мМ MOPS (или другой нетоксичный буфер), рН 7,4; 10 мМ глюкоз (клетки выделяют в среде инкубации с 10 мК пируватом)о

После инкубации клетки фиксируют в 3%-ной охлажденной хлорной кислоте, инкубируют 10 мин на холоде, доводят величину рН до 7,7 и центрифугируют для освобождения от выпавшего в осадок белка Для снижения концентрации Солей среду разбавляют в 3 раза 50 мМ трисацетатным буфером с 2 мМ ЕДТА рН 7,7, а затем измеряют АТФ по хеми- люминесценции люцефирин-люциферазной системы в среде инкубации, содержа- щей 50 мМ трис-ацетат; 13 мМ MgClij , 2 мК ЭДТА рН 7,7 о Измерения проводят на хемолюминометре.

Определение АТФ проводят в следующих вариантах: I. Перед инкубацией кле- ток. II, После инкубации клеток в течение 4 мин. III. После инкубации клеток в присутствии иссяедуемого в еществй в течение 4 мин.

833684

IV.После инкубации клеток в течение 2 мин добавляют разобщитель окислительного фосфорилирования и

г продолжают инкубацию еще 2 мин. Эту пробу повторяют, ступенчато увеличивая концентрацию разобщителя до тех пор, пока не начнется отчетливое снижение концентрации АТФ. Подобранную

JO таким образом концентрацию разобщителя используют при измерении по п. V, а соответствующую концентрацию АТФ - при расчетах.

V.После инкубации клеток в те- 15 чение 2 мин с исследуемым веществом

добавляют разобщитель (в концентрации, подобранной, как описано в 1 п. IV) и продолжают инкубацию еще 2 мин Вещества относят к биологически

ально опасные вещества), если концентрация АТФ в пробе III ниже, чем в пробе II и/или в пробе V ниже, чем в пробе IV. Эти вещества отбираются для дальнейших исследований и детальных испытаний их биологической активности. Измерения проводят на клетках, для которых концентрация АТФ в пробе II не ниже, чем в пробе I.

Измеряемые таким способом изменения в концентрации АТФ являются интегральными характеристиками клеток, величина которых отражает подавление энергетики и/или жизнеспособности „ клеток. Увеличение чувствительности метода достигается за счет того, что при изучении действия исследуемых веществ метаболизм клеток соответствует как состоянию покоя, так и активному состоянию (при стимуляции дыхания и АТФ-азных активностей после добавления разобщителя).

Пример 2. На фиг.1 показан пример выбора концентрации разобщителя окислительного фосфорилирования 2,4-динитрофенола (ДНФ), при которой начинается снижение концентрации АТФ, Концентрация АТФ начинает уменьшаться при 20-40 мкМ ДНФ. Эту концентрацию ДНФ и использовали в дальнейших опытах по изучению влияния исследуемых веществ на содержание АТФ. Примеры результатов этих опытов приведены ниже.

Пример 3, Ингибитор клеточного дыхания ротенон в концентрации 5 нМ слабо снижает содержание АТФ в суспензии лимфоцитов, однако при ин5148

кубации клеток в присутствии 20 мкМ ДНФ 5 нМ ротенон уменьшает содержание АТФ приблизительно в 1,5 раза, т.е. оказывает отчетливое повреждающее действие на энергетику клеток (таблица).

Пример 4. Менадион в концентрации 40 мкМ снижает АТФ почти в равной степени как при инкубации лимфоцитов в ДНФ, так и в опытах без разобщителя (таблица).

Приведенные примеры демонстрируют, что предлагаемый способ позволяет обнаружить как нарушения в клеточной энергетике, так и в целостности клеточной мембраны (снижение жизнеспособности). Формула изобретения

Способ определения повреждающего воздействия химических веществ на клетки in vitro путем инкубации химического вещества с тест-объектом определения изменения концентрации

Способ осуществляется путем инкубации лимфоцитов с исследуемым веществом и регистрацией концентрации АТФ с последующей оценкой биологической активности по сравнению с контролем. С целью повышения чувствительности способа в качестве контроля используют изменения в концентрации АТФ в присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования в среде инкубации, так и без разобщителя. При выявлении снижения концентрации АТФ в присутствии исследуемых веществ их относят к биологически активным, которые включаются, в частности, потенциально опасные химические вещества, способные вызвать изменения в энергетике и нарушении жизнеспособности клеток. Способ пригоден для выявления повреждающего действия физических факторов. Способ осуществляется с помощью устройства,которое содержит измерительную кювету, держатель кюветы со съемной конической крышкой, обеспечивающей быстрый доступ к кювете и светоизоляцию, внутренний корпус, в котором размещены светоприемник и операционный усилитель, внешний корпус. Устройство позволяет повысить чувствительность измерения за счет большого угла светосбора на фотокатоде светоприемника, так как фотокатод максимально приближен к измерительной кювете, а между ними установлен фотозатвор, в который вмонтирован держатель кюветы. Операционный усилитель собран на одной микросхеме. В качестве регистратора использован самопишущий потенциометр.

АТФ по сравнению с контролем с по- Изменение флуоресценции зонда (ро- 15 следующим выявлением повреждающих

дамин 123) в лимфоцитах показывает, что уменьшение концентрации АТФ вызвано нарушением целостности цито- плазматичеСкой мембраны.

Таким образом, этот пример показывает, что предлагаемый способ выявляет и вещества, снижающие жизнеспособность лимфоцитов, и по этому признаку менадион относится к потенциально опасным химическим веществам.

воздействий, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве тест- объекта используют лимфоциты тимуса,

20 определяют изменение концентрации АТФ в лимфоцитах, инкубированных с разобщителем окислительного фосфори- лирования и без него, а о наличии повреждающего воздействия судят по

25 снижению концентрации АТФ под действием химического вещества по сравнению с контрольной пробой. Влияние исследуемых веществ на концентрацию АТФ в суспензии лимфоцитов

О

О 20

20 О

О

0

0

253

270 130

85

270

208 195

145

0,1

Pus.t

Настю- -1- писец