Способ определения активности рибофлавинкиназы Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в научно- исследовательских лабораториях и в микробиологической промышленности для определения активности фермента рибофлавинкиназы (АТФ:рибофлавин-5 - фосфотрансферазы, К.Ф. 2.7,1.26). Рибофлавинкиназа катализирует реакцию фосфорилирования рибофлавина с образованием рибофлавин-5 -фосфа- та-флавинмононуклеотида (ФМН) т.е. осуществляют первую реакцию превращения витамина В в кофермеитные формы - ФМН и флавинадениндинуклео- ,тид (ФАД), которые входят в качестве простетических групп в состав целого

ряда окислительно-восстановительных ферментов - сЪлавопротеинов.

Цель изобретения - упрощение и удешевление способа.

Способ заключается в том, что инкубацию исследуемой пробы, содержащей рибофлавинкиназу, проводят в присутствии рибофлавина, аденозин-5 -трифосфата (АТФ) и ионов а количество образовавшегося ФМН определяют флуо- рометрией пр.обы после удаления из нее непрореагировавшего субстрата - рибофлавина при помощи транспорта этого вещества в клетки штамма дрожжей Pichia guilliermondii BKIIM У-432, содержащих высокоактивную и специфич05

Од

О

ро со

ную к рибофлавину транспортную систему - рибофлавинпермеазу.

Способ заключается в разделении не вступившего в реакцию с рибрфла- винкиназой субстрата - рибофлавина и образовавшегося продукта реакции - ФМН в результате связывания рибофлавина высокоспецифичной рибофлавин- пермеазой с последующим эффективным транспортом рибофлавина в клети дрожжей, Рибофлавинпермеаза P.guillier- mondii способна транспортировать в клетки дрожжей свободной рибофлавин и некоторые синтетические аналоги этого витамина, но не проявляет активности в отношении фосфорилирован- ной формы рибофлавина, а именно рибо- флавин-5 -фосфата-флавинмононуклеоти- да. После поглощения рибофлавина введенными в реакционную смесь дрожжевыми клетками он легко удаляется из реакционной смеси при помощи простых и доступных методов отделения клеток от жидкой фазы: центрифугиро- ванием, фильтрованием и т.д. После этого активность рибофлавинкиназы определяется непосредственным измерением флуоресценции исследуемой пробы по количеству образовавшегося в рибо- флавинкиназной реакции ФМН. , Определение.активности рибофлавинкиназы согласно способу проводится не по уменьшению количества субстрата - рибофлавина, а по накоплению продукта ФМН, что является необходимым условием при определении низких активностей исследуемого фермента. Рибофлавинкиназа относится к таким ферментам, содержание которых в клетках микроорганизмов, в тканях растений и животных невелико и составляет 3x10 - Зх1(Г4Е/мг белка.

Способ осуществляют следующим образом.v

Составляют реакционную смесь для определения активности рибофлавинкиназы, содержащая рибофлавин, АТФ, ионы Mg и компоненты буферной системы для создания оптимального зна- чения рН} смесь прибавляют к исследуемой пробе и инкубируют, реакцию, останавливают термоинактивацией ферментного белка, в реакционную смесь вводят дрожжевые клетки и пробу ин- кубируют в течение определенного промежутка времени, после чего клетки удаляют и активность рибофлавинкиназы определяют флуорометрией пробы.

Q 5 0 5

5

O ,

0

5

) На чертеже приведен график зависимости флуоресценции реакционной смеси от активности рибоАлавинкиназы в измеряемой, пробе.

Активность фермента определяют в реакционной смеси, содержащей рибофлавин в концентрации , АТФ - 3 х , MgSO 1 х и 0,02 MNa - фосфатный буфер рН 8,0. Пробы инкубируют в течение 1 ч при 37°С и прогревают на кипящей водяной бане 5 мин. К охлажденным пробам добавляют дрожжевые клетки из расчета 10 мг клеток (сухой вес) на 1 мл пробы, после чего пробы инкубируют с перемешиванием 30 мин при 30°С и удаляют осадок центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3 мин. В полученной надоса- дочной жидкости определяют концентрацию ФМН флуорометрией пробы на электрофлуориметре ЭФ-ЗМ. Интенсивность флуоресценции исследуемой пробы возрастает линейно в зависимости от содержания рибофлавинюшазы в пробе в диапазоне от 4 х 24 х 10 5Е/пробу (см„чертеж). За единицу активности (Е) рибофлавинкиназы принято количество фермента, необходимое для синтеза 1 мкмоль ФМН за 1 мин при 37°С.

В таблице приведены данные, полученные в результате определения активности рибофлавинкиназы в бескле- точных экстрактах ряда видов микроорганизмов, а также в частично очищенных препаратах этого фермента, полученных из штамма дрожжей P.guillier- mondii ATCC 9058. Активность рибофлавинкиназы в эксперименте определяли двумя способами: 1 - предлагаемым способом, 2 - способом, основанным на хроматографическом разделении субстрата и продукта рибофлавинкиназной реакции. Как видно из полученных данных, значения активности фермента в исследуемых пробах в обоих случаях определения практически не отличаются.

Клетки штамма дрожжей P.guillier- mondii ВКПМ У-432, содержащие рибофлавинпермеазу, легко получить культивированием на простых минеральных средах с добавлением в качестве источника углерода углеводов (глюкозы, сахарозы), этилового спирта или парафинов нефти. Полученная биомасса дрожжей хорошо сохраняется в охлажденном состоянии без существенной потери рибофлавинпермеазной активноети в течение 20-30 сут. Для использования в данном способе дрожжевые клетки не требуют какой-либо предварительной обработки. Биомассу дрожжей получают культивированием штамма P.guilliermondii ВКПМ У-432 в 500 мл колбах на качалке (200 об/мин) в среде, содержащей, г: сахароза 20, (Ш4)г80ф 3; КН2Р04 0,5; MgSO 0,2, дрожжевой экстракт 0,5, вода водопроводная до 1 л. Клетки из ранней стационарной фазы роста отделяют от среды центрифугированием и промывают дистиллированной водой. Полученную биомассу используют для определения активности рибофлавинкиназы сразу, либо сохраняют до использования во влажной камере в охлажденном состоянии при 0-4°С.

Способ иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. К исследуемой пробе объемом 0,5 мл, содержащей рибофлавинкиназу, прибавляют 0,5 мл реакционной смеси, содержащей 6 х рибофланин, 6 х , 2 х MgS04)0,04 М Na-фосфатный буфер рН 7,0 и пробу инкубируют при 37° С в течение 30 мин. После инкуба- ции пробу сразу же помещают в кипящую воду на 5 мин и затем охлаждают. К пробе прибавляют 0,1 мл 0,5 М раствора и 0,1 мл водной суспензии дрожжей штамма P. guilliermondii ВКПМ У-432, содержащей 100 мг клеток (су- хой вес) 1 мл. Пробу инкубируют с перемешиванием при 30°С в течение 30 ми и центрифугируют Змин при 1000 об/мин.

Затем 0,5 мл полученной надосадочной

,

жидкости помещают в флуорометричес- кую кювету, доводят объем дистиллированной водой до 8 мл и измеряют флуоресценцию раствора на электрофлуори- метре ЭФ-ЗМ. Активность рибофлавин- киназы в исследуемой пробе рассчитывают по формуле:

Активность рибофлавинкиназы Ф х К (Е),

где Ф - показания флуориметра в единицах флуоресценции; К - коэффициент пропорциональности;

К- 8,5 х Ю, если цена деления шкалы флуориметра установлен равной 0,01 мкг флавина.

Например, показание флуориметра при определении активности рибофлавинкиназы в пробе равно 55 единиц флуоресценции. Тогда активность рибофлавинкиназы в исследуемой пробе составляет: 55 х 8,5 х 46,75 х

Пример 2. Определение активности рибофлавинкиназы аналогично описанному в примере 1 за исключением состава реакционной смеси, содержащей 5 х рибофлавин, 5 х АТФ, 1 х 0,04 М Na-фосфатный буЛер рН . Количественно определение активности рибофлавинкиназы в исследуемой пробе аналогично описанному в примере 1.

Формула изобретения

Способ определения активности рибофлавинкиназы, предусматривающий инкубацию исследуемой пробы, содержащей фермент, рибофлавин, аденозин- 5 -трифосфат и ионы Mg2, отделение субстрата - рибофлавина от продукта ферментативной реакции флавин- мононуклеотида и измерение количества последнего в пробе, отличающийся тем, что, с целью упрощения- и удешевления способа, по окончании инкубации в реакционную смесь добавляют штамм дрожжей Pichia giiil- liermondii ВКПМ У-432, содержащий специфичную к рибофлавину транспортную систему рибофлавинпермеазу, а отделение рибофлавина осуществляют посредством транспорта рибофлавина в клетки дрожжей.

Бесклеточные экстракты, Brevibacterium flavum

АТСС 13032 r4,3

Bacillus subtilis Shgw 19,0 Hansenula poiytnorpha

ВНИИ Генетика ML 837,3

Candida boidinii ВСБ-719 43,6 Pichia guilliermondii ATCC 905817,8

Очищенные препараты

фермента

Осажденный (№4)2.4

(0,4-0,9 ед. насыщения) 36,4 Осужденный этиловым

спиртом (50-8U%)28,0

Фракционированный на сефадексе G-100228,4

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения активности соерментов, а именно рибофлавинкиназы (АТФ:рибофлавин- 5 -фосфотрачс(Ьера-эы9 К.Ф. 2.7.1.26). Целью изобретения является упрощение и удешевление способа. Способ заключается в том, что инкубацию исследуемой пробы, содержащей рибофлавин- киназу, проводят в присутствии рибо- флавина, адекоз к-Н -трифосфата и ионов , а колии ство .образовавшегося ФМК определяет флуориметрией пробы после удаления из нее непрореагировавшего субстрата-рибофлавина при помощи транспорта этого вещества в клетки дрожжей Pichia guiller- mondii ВКПМ 4-432, содержащих высокоактивную и специфичную к рибофлавину транспортную систему - рибофла- винперлиазу. 1 ил., 1 табл. i

I

8

го ю