Питательная среда для выращивания неспоровых бактерий Советский патент 1989 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в микробиологической промьшшенности для культивирования микроорганизмов, требующих для своего роста питаль- ные среды, содержащие мясные экстракты о

Цель изобретения - удешевление, увеличение выхода биомассы и уменьшение сроков выращивания продуцентов .

Готовят питательную среду на основе экстракта водородокисляющих бактерий Alcaligenes eutrophus ВКМ В-1323.

Для приготовления экстракта 50- 150 г биомассы водородокисляющих бактерий суспензируют в 1 л дистиллированной воды, подкисленной соляной кислотой до значения рН 3,0- 3,5. Суспензию выдерживают на кипящей водяной бане в течение 1,0-1,5 ч. После охлаждения остатки клеток бактерий отделяют от экстракта центрифугированием. Экстракт нейтрализуют раствором гидрата окиси натрия.

Экстракт, полученный таким образом, имеет следующий состав, г/л: Азот общий 2,1 Азот аминный 0,350

:о

ел

Углероды об11Д1е2,3

Нуклеиновые компоненты2, 1

Аминокислоты:

Лизин0,661

Гистидин0,116

Аргинин0,256

Аспарагиновая

кислота0,673

Треонин0,263

Серин0,178

Глутаминовая

кислота0,620

Пролин0,193

Глицин0,285

Аланин0,458

Цистин0,545,

Валин0,325

Метионин0,089

Изолейцин О,172

Лейцин0,292

Тирозин0,123

Фенилаланин 0,176

Питательную среду для выращивания микроорганизмов на основе экстракта водородокисляющих бактерий готовят из расчета содержания аминного азота в среде 60-240 мг/л, добавляя Б среду необходимые компоненты: пеп- тон в количестве 0,9-1,1% и хлористый натрий 0,5-0,7%.

Пример 1. К экстракту водородокисляющих бактерий с содержанием аминного азота, равным его содержа- нию в мясной воде (120 мг/л), добавляют 1% пептона и 0,5% NaCl. В колбы объемом 500 мл вносят 200 мл приготовленной среды и автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин. Затем.в ере- ду вводят 1 мл инокулята суточной суспензии Escherichia coli . Ежесуточно измеряют прирост биомассы на мембранных фильтрах. Для этого используют предварительно высушенные до по стоянного веса мембранные фильтры № 8 Синпор. Через фильтр пропускают 10 мл культуры E.coli, затем его высушивают до постоянного веса. Разница в весе фильтра до и после фильтрации культуры составляет суточ HbDi прирост биомассы бактерий E.coli Как видно из результатов, представленных на фиг.1, среда, содержащая азот в количествах, близких к со- держанию его в контроле, благоприятна для развития E.coli. В первые трое суток роста прирост биомассы E.coli на опытной и контрольной средах поч5

ти одинаков, на четвертые сутки отечено увеличение скорости роста E.coli на опытной среде, в результае чего прирост биомассы более чем 2 раза (кривая 5) превысил прирост в контроле (кривая 3).

Пример2. К экстракту водо- одокисляющих бактерий с концентрацией аминного азота 60 мг/л добавяют 1% пептона и 0,5% NaCl. В колбы объемом 500 мл вносят 200 мл приготовленной среды и автоклавируют в течение 30 мин. Затем в среду вводят 1 мл инокулята суточной суспензии E.coli N50-111. Ежесуточно измеряют прирост биомассы на мембранных фильтрах. Как видно из результатов, представленных на фиг.1, данная среда благоприятна для развития E.coli. Уже на третьи сутки наблюдается нанг больший прирост биомассы, превышающий прирост в контроле почти в 3 раза (кривая 4)-.

Пример 3. К экстракту водо- родокисляющих бактерий с содержанием аминного азота 40 мг/л добавляют 1% пептона и 0,5% NaCl. В колбы объемом 500 мл вносят 200 мл приготовленной среды и автоклавируют в течение 30 мин. Затем в среду вводят 1 мл инокулята суточной суспензии E.coli NSO-111. Ежесуточно измеряют прирост биомассы на мембранных фильтрах. Как видно из результатов, представленных на фиг.1, на данных средах прирост биомассы ниже контрольного в 2-5 раз (кривые 1 и 2), что связано с лимитированием роста культуры E.coli азотом.

Пример4. К экстракту водо- родокисляющих бактерий с содержанием аминного азота 240 мг/л добавляют 1% пептона и 0,5% NaCl. В колбы объемом 500 мл вносят 200 мл приготовленной среды и автоклавируют в течение 30 мин. Затем в среду вводят 1 мл инокулята суточной суспензии E.coli N20-t11. Ежесуточно измеряют прирост биомассы на мембранных фильтрах. Как видно из результатов, представленных на фиг.1, прирост биомассы на данной среде уже на третьи сутки превосходит прирост в контроле соответственно в 2-2,5 раза (кривые 6 и 7).

Пример5. К экстракту водо- родокисляющих бактерий с содержаниемобщего азота в 3 и аминного азота в 6 раз больше, чем в контроле, добавляют 1% пептона и 0,5% NaCl. В колбы объемом 500 мл вносят 200 мл приготовленной среды и автоклавируют в течение 30 мин. Затем в среду вводят 1 мл инокулята суточной суспензии E.coli N 0-111. Ежесуточно измеряют прирост биомассы на мембранных фильт pax. Как видно из результатов, представленных на фиг.1, уже на вторые и третьи сутки прирост биомассы значительно превосходит контроль (кривая 8). На четвертые сутки прирост биомассы был в 5 раз больше, чем в контроле, и в 2 раза больше, чем на среде, приготовленной из экстракта водородокисляющих бактерий с содержанием общего азота равным контролю, Примерб. К экстракту водородокисляющих бактерий добавляют 1% пептона и 0,5% NaCl. В колбы объемом 50Р мл вносят 200 мл приготовленной среды и автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин. Затем в среду вводят 1 мл инокулята суточной суспензии Pseudomonas aCruginsa 6080. Ежесуточно измеряют прирост биомассы на мембранных фильтрах. Как видно из результатов, представленных на фиг.2, наибольший по сравнению с контролем (кривая 3) прирост биомассы Ps.aeruginosa 6080 наблюдается на средах, приготовленных на основе экстракта водородокисляющих бактерий с содержанием аминного азота 120мг/л «(кривая 5) или в 2 раза меньшим (кривая 4). На средах, приготовленных на основе экстракта водородокис- ЛЯЮ1ЦИХ бактерий с содержанием аминного азота 30-40 мг/л, прирост биомассы уже на третьи сутки резко падает (кривые 2 и 1), уменьшаясь по сравнению с контролем соответственно в 3 и 14 раз. I

Пример. К экстракту водородокисляющих бактерий добавляют 1% пептона и 0,5% NaCl. В колбы объемом 500 мл вносят 200 мл приготовленной среды и автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин. Затем в среду вводят 1 мл инокулята суточной суспензии Staphylococcus aureus 453. Ежесуточно измеряют прирост биомассы на мембранных фильтрах. Как видно из результатов, представленных на фиг.З, на среде, приготовленной на основе экстракта водородокисляющих

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

бактерий с концентрацией аминного азота 120 мг/л, уже на третьи сутки прирост биомассы St.aureus (кривая 3) равен приросту в контро. ;е (кривая 2) .

На среде с экстрактом водородокисляющих бактерий, имеющим концентрацию аминного азота 60 мг/л, отмечается резкое увеличение скорости роста St.aureus (кривая 5). На третьи сутки роста прирост биомассы на данной среде выше контрольного в 3 раза. На средах, приготовленных на основе экстракта водородокисляющих бактерий с содержанием аминного азота 30-40 мг/л, прирост биомассы St.aureus сначала возрастает, затем начинает падать до уровня контроля (кривая 3) или становится меньше контроля в 1,5 раза (кривая 1).

П р и м е р 8. Экстракт водородокисляющих бактерий использовали как составную часть элективной для ста-, филококка питательной среды - желточ- но-солевого агара. Готовят контрольную питательную среду на основе мясной воды из говяжьего мяса. Контрольная среда содержит на 1 л мясной воды 10 г пептона, 65 г хлористого натрия, 35 г агар-агара, рН 7,2-7,4. В стерильную среду, охлажденную що 56 С, вносят асептически 330 мл эмульсии яичного желтка и разливают по чашкам Петри. Аналогично готовят опытную среду с заменой мясной воды з кстрак- том водородокисляющих бактерий Alca- ligenes eutrophus ВКМ В-1323 с различным содержанием амирного азота. Сравнение опытной и контрольной питательных сред проводят в трех направлениях:

определение скорости роста;

определение всхожести бактериальной культуры;

подтверждение постоянства свойств культуры, определяющих ее патоген- ность.

Для определения всхожести используют метод серийных разведений с высевом на опытные и контрольную среды определенной дозы культуры (от 1 млрд до to клеток в 1 мл суспензии) . Посевы инкубируют в течение 24 ч при 37°С, а затем 24 ч при комнатной температуре. Учет результатов проводят через 17; 24; 36 , Всхожесть культуры St.aureus 453 в зависимости от концентрации аминного азота экстракта Alcaligenes outro phus ВКНВ-1323 водородокисляющих бактерий и посевной дозы представлены в табл.1 .

Из табл.1 видно, что всхожесть St.aureus 453 во всех опытных образцах близка или незначительно превышает таковую на контрольной среде. При содержании аминного азота в опытной среде 17 мг % (170 мг/л) наблюдаются наилучшие результаты по всхожести. Согласно требований нормативно-технической документации число выросших колоний подсчитывают через 48 ч инкубации. Во всех опытных вариантах число колоний через 48 ч не изменилось по сравнению с числом колоний, учтенных через 17 ч,, что свидетельствует о высокой скорости роста на испытуемых средах. Применение новых сред позволяет сократить время анализа на 1 сут.

Одним из важных физиологических и диагностических признаков патогенного стафилококка является образование лецитовителлазного венчика вокруг колоний. Этот признак на опытных средах четко проявляется уже через 17 ч (при 10 пассажах), в то время как в контроле он проявляется через 24-48 ч. Колонии на опытных средах превосходят по величине колонии в контроле в 1,5-2 раза (3 мм в диаметре в опыте против 1-2 мм в контроле) .

Таким образом, замена мясной водь экстрактом водородокисляющих бактерий для St.aMreus сказалась благоприятно на всхожести, скорости роста и устойчивости физиологических свойств (в частности, образования лецитовителлазного венчика).

П р и м е р 9. Основным дифференциально-диагностическим тестом дифтерийной палочки Corynebacteria diphtherial gravis 665 является наличие фермента цистиназы. Цо скорости синтеза зтого фермента судят об активности культуры. Эти свойства определяются скоростью ферментативного расщепления цистина и образованием из него сероводорода, взаимодействующего с усксуснокислым свинцом с образованием сернистого свинца (соединения темнокоричневого цвета). Для этой цели используют среду следующего состава: 0,5 л мартеновского пептона; 0,5 л мясной воды; 15 г агар-агара; 22 мл 1%-ного раст

вора цистина; 10 мл 10%-ного раствора уксуснокислого свинца и 90 мл лошадиной или бычьей сыворотки.

Среду разливают столбиком высотой 2-3 см. Посев культуры производят уколом. Результаты учитывают через 20-24 ч с момента посева. При посеве уколом коринебактерии дифтерии образуют интенсивное потемнение по ходу укола и вокруг него характерное облачко темно-коричневого цвета на расстоянии 1 см от поверхности агара. Опытную среду готовят аналогично примерам 1-7, но с различной концентрацией аминного азота (табл.2).

В табл.2 дана скорость образования и диаметр облачка в зависимости от концентрации аминного азота.

Из результатов, представленных в табл. № 2 видно, что скорость образования облачка, а следовательно, и скорость выявления дифтерийной палочки в опыте значительно превосходит контроль. Интенсивность окрашивания и диаметр облачка в опытных средах также превосходит эти показатели в контроле. Исключение составляет опытная среда, содержащая экстракт водородокисляющих бактерий с низкой концентрацией аминного азота (3 мг %). Причиной этому является, вероятно, лимит по азоту. Таким образом, испытанные среды пригодны для

выявления С.diphtherial gravis и позволяют в более ранние сроки дифференцировать патогенные виды этого рода бактерий от непатогенных.

Формула изобретения

5

0

5

Питательная среда для выращивания неспоровых бактерий, содержащая источник углерода и аминного азота, пептон и хлористый натрий, отличающаяся тем, что, с целью удешевления, увеличения выхода биомассы и сокращения сроков культивирования продуцентов, среда содержит в качестве источника углерода и аминного азота кислотный экстракт водородокисляющих бактерий Alcali- genes eutrophus ВКМ В-1323 в количестве, обеспечивающем содержание аминного азота от 60 до 240 мг/л, при следующем соотношении компонентов среды, г/л:

Пептон9,0-11,0

Хлористый натрий

Экстракт водо- родокисляющих

бактерий с содержанием аминного азота от 60 до 240 мг/лДо л.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для культивирования неспоровых бактерий. Цель изобретения - удешевление среды, увеличение выхода биомассы и сокращение сроков культивирования. Изобретение заключается в том, что в качестве углерод и азотосодержащей основы питательной среды для неспоровых бактерий, содержащей пептон (0,9-1,1мас.%) и хлористый натрий (0,5-0,7 мас.%), используют кислотный экстрактводородокисляющих бактерий ALCALIDEHES EUTROPHIS ВКМ В-1323 в количестве, обеспечивающем содержание аминного азота от 60 до 240 мг/л. 3 ил. 2 табл.

Примечание. ++++ +++ Таблица 1

Таблица2

диаметр облачка 10 мм и более, темно-коричневого цвета;

диаметр облачка 7-10 мм, коричневого цвета; диаметр облачка 3-7 мм, светло-коричневого цвета; отсутствие облачка, почернение среды по уколу.

1л U

t

5 V

I

l.

0

j

Фи9.1

Ф вмя еутии

Г/Л

oa

Ь

I

v

0,10

к

I

u J

Редактор М.Петрова

Составитель Е.Воробьева

Техред Л.Олийнык Корректор Т.Малец

Заказ 3651/29

Тираж 500

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

фАт, еутни

9ui.Z

J емя сутли

Подписное