Способ получения биомассы,обогащенной полинуклеотидфосфорилазой Советский патент 1979 года по МПК C12D13/10 

Изобретение относится к способу получения микробильны.х биомасс, обогашенных биологически активными веществами.

Известны методы получения биомасс с полинуклеотидфосфорилазной активностью из родов .Azotobacter, Micrococcus, Pseudomonas, Aerobacter, Proteus, Bacillus, Serratia, Xanthomonas, Achromobacter, Escherichia.

Известен способ получения биомасс из Escherichia coli с полинуклеотидфосфорилазной активностью, предусматривающий использование Escherichia coli с активностью ,jj 1 ед/мг белка 1 .

Наиболее близким по технической cyni.ности и достигаемому результату является способ гюлучения биомассы, обогащенной полииуклеотид()зосфорилазой, предусматривающий культивирование бактерий Escherichia coli на питательной среде, содержаплей

пептон 2%, глюкозу - 0,2о/о, КНгРОл 0,1 тМ .а2НРО4 - 0,1 тМ (NHd)2 SO. - 0,2%, MgSO., -- 0,01%. EeSO, -- 5 мг/л. Условия культивирования: рН питательной среды - 7,4, температура - 37.

Результаты культивирования: выход биомассы (по сухому весу) - Зг/л, aKTiiiiHOCTb фермента - 0,88/.|МР/мг белка 2.

Недостатками известного процесса является недостаточно высокий выход биомассы, так как не обеспечивается в полной мере питание органическим азотом, и недостаточно высокая активность по,чинуклеотидфосфорилазы в биомассе; что обусловлено низкой продуктивностью щтамма и тем, что гп1тательная среда не обеспечивает достаточного углеводного питания, не обладает стабилизированной буферной системой и содер ит нон аммония, который нодавляет накопление фермента в биомассе.

Це, предлагаемого изобретения является увеличенне выхода биомассы с повыщенной по,пинуклеотидфосфорн,1азной активностью.

Поставленная иел1) достигается тем, что из штаммов Escherichia coli исно.чьзуют ипамм MRE- 600. а в состав питате,1ьной среды дополн11те,1ьно вводят лимонную кислоту, гидролизат казеина и дрожжевой экстракт, при утом глюкозу, пептон и фосфаты берут в соотношении 1:0,02:1,66, а ко личество лимонной кислоты устанавливают раврлям 0.025% от объема среды. Предлагаемое техническое решение обеспечивает увеличение выхода биомассы, обогащенной гюлинуклеотидфосфорилазой до 4,5-5 1-/Л, и повышение активности фермента до 20-25ед/мг белка. Использованный в качестве продуцента штамм E.coli MRE-600 является мутантом, не способным синтезировать Г НК-азу I и обладает повышенной способностью синтезировать ПНФ-азу. Штамм Escherichia coli MRE-600 получг н из коллекции музейных культур Гос. контрольного института и.м. А. А. Тарасевича в 1972 г.и имеет следующую характеристику. Морфология: палочки с раз.мерами (1,5-2,5) X (0,3-0,6)jfl, грамотрицате.;1ьны, споры не образуют, подвижны. Физиолого-биохимические свойства: факультативный анаэроб, желатя у не разжижает, культура растет на синтетических средах, преимундествень:о используют аммиачный а:,от, также растет на средах с пептоном, дрожжевым автолизатом, ги;Чролизатом казеина, свободный азот не фиксирует. Отношение к источникам углерода: сбраживает :vioHo-, .аи- и полисахариды, спирты и органические кислоты. Из последних слабо использус { умаровую и винокаменную кислоту, не использует лимонную и яблочную кислоты. В процессе роста нлтамм образует аммиак, сороиодоро.ч, 11дол, восстана ливает нитраты до нитритов. Культура |)астет при рН 5-9, оптимум рН роста 6-7, температура роста 30-37°С, имеет дезами11ирую1иие и декарбоксилирую|цпе способности. Наряду с использованием нового штамма согласно предлагаемому изобретению в состав питательной среды вводят лимонную кислоту как индуктор нолинуклеотидфосфо рилазы и стабилизатор буферной системы. Присутствие лимонной кислоты в нита-тельной ереде влияет на реакции цикла трикарбоновых кислот клетки, таким образом сдвигая окислительные процессы клетки, косвенно вызывая усиление биосинтеза ПНФазы. Лимонная кислота в питательной среде повышает растворимость солей магния и солей других двухвалентных металлов и тем самым стабилизирует фосфатно-буферную систему питательной среды, препятствуя образованию нерастворимых фосфатов и выпадению их в осадок. Таким образом, ионы магния и фосфатов становятся более доступными для питания клеток, что способствует приросту биомассы. Стабилизированная буферная система предотвращает преждевременное подкисление питательной среды во время роста культуры и обеспечивает повышенный выход биомассы. Введение в питательную среду глюкозы, пептона и фосфатов в cooTHonjeHHH 1:0,02: : 1,66 оказывает значительное воздействие на дыхательную функцию, вызывая дисбаланс в синтезе макроэргических соединений фосфора и синтеза РНК. Выращивание клеток мри низшей точке оптимальных температурных пределов роста, т.е. при 28-30°С, также уменьшает дыхательную активность клеток. Снижение дыхательной активности вызывает повышение концентрации ортофосфатов в клетке и дегарадацию РНК в ней, что способствует биосинтезу и накоплению полинуклеотидфосфорилазы. В питательную среду для обеспечения разнообразия органического азота добавляют также гидролизат казеина и дрожжевой экстракт. Таким образом способ заключается в следующем: в качестве продуцента ПНФ-азы используют штамм E.scherich,a соИ MRE-600. Для получения биомассы, обогашенной полинуклеотидфосфорилазой, культуру выращивают на синтетической питательной среде следующего состава: Пептон0,1% Гидролизат казеина1-2% Дрожжевой экстракт0,1-0,2% Р(НгРО 25-30 тМ NaiHPO425-ЗОтМ MgSO40,025% Лимонная кислота0,025°/о Глюкозу в количестве 4-5% вводят в питательную среду в виде стерильного раствора. Макси.мум биосинтеза иолинуклеотидфосфорилазы достигается к 6-ому час культивирования. Результаты культивирования. Выход биомассы4,5-5,0 г/л, Активность ПНФ-азы 20 ед/мг белка. После ферментации биомассу отделяют сепарацией и замораживают. В таком виде ПНФ-азная активность сохраняется до 6 месяцев без потерь. Пример 1. В качестве продуцента ПНФ-азы используют культуру E.coli MRE-600. Питательная среда содержит: Пептон0,1% Гидролизат казеина1% Дрожжевой экстракт0,1 % КН5РО430 тМ Na2HPO430 тМ MgSO40,025% Лимонную кислоту0,025% 1% глюкозы вводят в питательную среду в виде стерильного раствора в начале ферментации, остальные 4% - к 4-му час ферментации, рН питательной среды поддерживают на уровне 7,5-7,6 при помощи 50%-ного раствора КОН.

Выращивание микробной биомассы Е. соН MRE-600. Культура Е. соИ MRE-600 поддерживается на столбиках МПА под вазелиновым маслом, пересевается 1 раз в год. I. Выращивание посевного материала. Культуру пересевают на косяки и выращивают 24 час, после чего культуру пересевают в колбу со 100 мл питательной среды, инкубируют стационарно 10-12 час. Инокулят готовят, пересевая 10-12 час культуру на 800 мл свежей среды из расчета 1:10 и выращивают на качалке при 37°С, 100 об/мин 3 час. 2. Ферментация культуры E.coli MRE-600 производится после добавления инокулята из расчета 40мл культуры на 1л питательной среды. Ферментацию ведут при температуре 29-31°С в условиях принудительной аэрации (2л возду.ха/л питательной среды).

Во время фер.ментации контролируют однородность культуры, прирост биомассы, рН. Выход бид.массы - 4,5 г/л. Активность ПНФ-азы - 25 ед/мг белка.

Пример 2. Состав питательной среды:

Пептон

0,

Гидролизат казеина

Дрожжевой экстракт 0,20/0

KHjPO. 25 тМ

МагНРОч 25 п;М 0,25%

MgS04

Лимонная кислота 0,25%

Глюкозу в виде стерильного вводят по 1% через О, 1,2,3,4 чавирования. Остальные операции осют как в примере 1.

Выход биомассы - 5 г/л

Активность полинуклеотидфосфорилазы 20ед/.мг белка.

Таким образом, предлагаемое изобретение обеспечивает выход биомассы - 4,5- 5 г/л и активность полинуклеотидфосфорилазы 20--25 ед/мг белка.

Формула изобретения

Способ получения биомассы, обогащенной иолинуклеотидфосфорилазой, предусматриваюо ий культивирование Escherichia соИ на питательной среде, содержащей глюкозу, пептон, сернокислый магний и фосфаты, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биомассы и интенсификации накопления полинуклеотидфосфорилазы, из щтаммов Escherichia coli используют щтамм MRE-600, а в состав питательной среды дополнительно вводят лимонную кислоту, гидролизат казеина и дрожжевой экстракт, при этом глюкозу, пептон и фосфаты берут в соотношении 1:0,02:1,66.

2. Способ по п. 1. отличающийся тем, что лимонную кислоту вводят в количестве 0,025% от объема питательной среды.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Авторское свидетельство СССР № 401667, кл. С 07 Н 22/03, 1973.

2.J. R. Williams, М. Grunberg-Manago. Polinujleotide phosphorilase hautement purificL a partu de E.coli. - «Biochem Biohys , 89, p. 66.