Способ определения состояния фибринолитической системы крови Советский патент 1989 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к медицине, а именно к области лабораторных методов диагностики нарушений системы гемостаза, в частности фибринолиза.

Из известных способов исследования фибринолиза наиболее близким по технической сущности является метод исследования ХИа-калликреин-за- висимого лизиса по Г.Ф.Еремину и А.Г.Архипову. Для его осущестьле-ния используют еледукицие реактивы: 3,8%- ный раствор цитрата натрия , 1 %-ная уксусная кислата,буферМихаэлиса (рН 7,4- 7,6), суспензия каолина (5 мг/мл) 0,277%-ный раствор хлорида кальция, дистиллированная водл.

Ход определения: п(1лучан1Т бедную тромбоцитами плаяму н условиях минимальной контактном актирлции пПычным способом, в процессе выделения эуглобулиновой фракции, фактор ХГ1 подвергают контактной активации каолином, образуется комплекс ф.ХИа- высокомолекулярной кининоген-прекал- ликреин, который активирует плазми- ноген. Полученные эуглобулины, со- держапще плазмин, растворяют в буфере Михаэлиса, и сразу после доб.ш- лення хлорида кальция засекают время по секундомеру. В норме полный лизис происходит за 4-12 мин. Задержьм лизиса свидетельствует .о недостаточности внутреннего Х11а-зависимог - механизма фибринолиза.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Цель достигается тем, что и способе оценки фибринолиза, включлк.пч-м

4

СО ю

N9

00

получение активированных каолином эуглобулинов, активированные эугло- булины получают из исследуемой плазмы после ее дефибринации при Зб-ЗТ С в течение 3-10 мин, затем определяют фибринолитическую активность дмеси растворенных активированных зуглобу- линов исследуемого и неактивированных каолином эуглобулинов, полученных из пула плазм здоровых людей, взятых в равных количествах, вызывая образование сгустка добавлением хлорида кальция, причем при. времени лизиса свьппе 45 мин диагностируют депрессию фибринолиза, а при времени лизиса менее 33 мин - актива цию, фибринолиза

Способ осуществляют следующим образом.

Реактивы используют те же, что и в известном способе.

Бедную тромбоцитами плазму, полученную в условиях минимальной контактной активации, прогревают в течение 3-10 мин при Зб-ЗУ С, затем центрифугируют при 1200-1400 g в течение 13 мин. Осадок удаляют. Полученный дефибринат инкубируют с каолином при разведении в 16 раз в кислой среде (рН 3,0). Это приводит к выпадению эуглобулинов, содержащих плазмин. Смесь центрифугируют при 400 g в течение 6 мин, надосадочную жидкость сливают и растворяют осадок в буфере Михаэлиса (количество буфер равно количеству взятого дефибрината

В качестве субстрата используют эуглобулины из пула плазм 10 здоровых людей, полученные обычным способом (по Kowarzik): 0,3 мл плазмы вносят а 8,0 мл дистиллированной воды с 0,18 мл 1%-ной уксусной кислоты смесь пнкубируют- 30 мин при 4 С и центри(.)угируют при 400 g в течение 6 мин. Надосадочную жидкость сливают, а зуглобулины растворяют в 0,3 м буфера Михаэлиса.

Берут 0,23 мл активированных эуглобулинов из дефибрированной плазмы исследуемого и 0,23 мл субстрата, смешивают их в водной пробирке, смесь свертывают 0,3 мл СаС1г . (0,277%) и включают секундомер.. Засекается время лизиса образовавшегося сгустка. Исследование проводится на водяной бане при 37 С.

У здоровых людей полный лизис происходит за 33-43 мин. Удлинение вре

5

0

мени лизиса свидетельствует о снижении фибринолитической активности плазмы. Так, при тромбозах и синдромах ЛВС время лизиса часто удлиняется до 70-80 мин.

Клиническая апробация способа оценки фибринолиза была проведена у 14 здоровых людей, у 9 больных с массивными венозными тромбозами, У 6 больных с синдромом ЛВС.

Результаты представлены в табл.1.

Из представленных данных видно, что при тромбозах и синдромах ЛВС время лизиса удлиняется в 1,3 раза, во всех случаях время лизиса превышает 43 мин (М t 2А).

Для выяснения возможности регистрации активации фибринолиза проведена серия экспериментов с добавлением разных концентраций стрептокина- зы в плазму (препарат фирмы VEB ABZNEIMITTEU fERX DRESDEN Awelysin). Использовались концентрации стрепто- 5 киназы, применяемые для лечения больных с тромбозами.

Результаты (средние данные из трех серий экспе11иментов) приведены в табл.2.

Из представленных в табл.2 данных видно, что исследование фибринолиза предлагаеь ым способом позволяет выявить степень . активации фибринолиза, время лизиса менее 33 мин (М±2й), тогда как исследование по известному способу в этих условиях невозможно.

Для определения оптимального режима прогревания с целью последующего исследования фибринолиза приведена серия экспериментов по определению зависимости времени лизиса по предлагаемому способу у здоровых людей от температуры и времени дефибринации плазмы.

Результаты представлены в табл.3.

Из табл. 3 видно, что оптимальное время дефибринации для предлагаемого способа 3-10 мин при 36-37 0. Дальнейшее прогревание приводит к значи- тель ному удлинению времени лизиса.

Пример 1. Больной В., 33 лет. Диагноз: хронический миелолейкоз, терминальная стадия, ДВС-синдром, гематома нижней трети правой голени, е Результаты лабораторного исследования системы гемостаза: аутокоагуляци онный тест (АКТ) на 10 мин - 10с; каолин-кефалиновое время свертывания (ККВС) 47с (контроль 47с);

0

5

0

5

0

протромбиновое время 23с (контроль 17с); тромбиновое время 14с (контроль I 5с) ; этаноловьгй тест положителный; протаминсульфатный тест положительный.

Изменения компонентов системы гемостаза, участвующих в функционировании фибринолиза, представлены в табл.4.

Из табл.4 видно, что время лизиса в известном способе и предлагаемом удлинено вследствие снижения количества плазминогена, ВМК и ПК. Количество фибриногена у больного было нормальным, В данном случае результаты исследования по предлагаемому способу и :известном совпадают. Вместе с тем, удлинение времени лизиса по известному способу на 2300% неадекватно, так как явно превышает во много раз степень снижения основных компонентов, принимающих участие в регуляции фибринплиза. Нарушение фибринолиза, выявленное с помощью предлагаемого способа, соответствует степени снижения этих компонентов.

Приме р 2. Больная 1IJ,, 65 лет Диагноз: правосторонний илеофемораль ный тромбоз.

Результаты лабораторного исследования систем гемостаза: АКТ на 10 ми 8 с, ККВС 40 с (контроль 46 с) протромбиновое время 18 с .(контроль 17 с), тромбиновое время 14 с (контроль 16 с), этаноловый тест положительный, протаминсульфатный тест положительный .

Изменения компонентов системы гемостаза, участвующих в функционировании фибринолиза, приведены в табл.5.

0

5

0

В данном случае удлинение времени лизиса по известному способу было ложным и обусловлено гиперфибриноге- немией. Определение фибринолиза предлагаемым спо;собом не выявило его нарушения, что соответствовало нормальному содержанию ВМК, ПК и плазминогена .

Формула изобретения

Способ определения состояния, фибринолитической системы крови путем получения плазмы крови, обработки ее каолином, отделением эугло- булиновой фракции, добавления к ней раствора хлористого кальция и регистрации времени лизиса образовавшего-, ся сгустка, о тличающийся

способа, плазму 1редварительно нагревают в течение 5-10 мин при 56- , перед добавлением хлористого

кальция эуглобулиновую фракцию смешивают в соотношении 1:1 с фракцией зуглобулинов, неактивироваиных каолином и полученных из плазмы крови доноров, при этом при времени лизиса

сгустка меиее 35 мин определяют активацию, а более 45 мин - депрессию фибринолитической системы.

Т а б л и ц а 1

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным функциональным методам диагностики нарушений гемостаза ,в частности, фибринолиза. Целью изобретения является повышение точности способа. Способ заключается в том, что исследуемую плазму дефибринируют, затем получают эуглобулины, не содержащие фибриногена и лишенные активности С₁-ингибитора, и активируют их каолином. Определение времени лизиса ведут при добавлении к контрольным эуглобулинам активированных эуглобулинов из дефибринированной плазмы. Удлинение времени лизиса более 45 мин свидетельствует о депрессии фибринолиза, а укорочение менее 35 мин - об активации фибринолиза. При тромбозах и синдромах ДВС время лизиса часто удлиняется до 70-80 мин.

30

20

15

Сгус- Сгус- Сгус- Сгус- Сгусток не ток не ток не ток ток не образо-обра- обра- не об-обра- вался зовал- зовал- разо- зовался

Таблица2

Сгус- Сгусток ток не не об-обра- разо- зовался

42 6

ся

ся

вался

Температуря дефиб- ринации, Г,

56-57 59-60

Время лизиса по известному способу

Время лизиса по

предлагаемому

способу

Высокомолекулярный кининоген, ВМК

Плазменный прекал- ликреин, ПК,мкМоль ВАМЭ/л/мин

Резерв плазминогена,%

Количество фибриногена, г/л

ТаблицаЗ

Время лизиса при времени прогревания, мин

10 1 20

42 72 124 147

Таблица4

2300

40,3

86

0,2140,530

60

82

59

100

74

3,4

2,9

Таблица5