Способ определения количества реакционных центров фотосистемы-2 растений Советский патент 1989 года по МПК A01G7/00 

Изобретение относится к биохимии, биофизике и физиологии фотосинтеза растений, а именно к способам определения количества реакционных центров (РЦ) растений, и может быть использовано в исследованиях структурно-функциональной организации пигментного аппарата фотосистемы-2 (ФС-2).

Известный способ применим только для хлоропластов и субх-поропластных препаратов, обогащенных ФС-2, высших растений и субхлоропластных препаратов ФС-2 низших растений и требует значительных затрат времени.

Целью изобретения является повышение точности способа, Достижение его универсальности и сокращение времени анализа.

Пример 1. Для определения копичествл 1 Ц сугпензию клеток

водоросли помещают в среду,содержащую 15-20 мм трис-HCl буфер (рН 7,8), 35-40 1 NaCl, 2 мМ MgCl и инкубируют при комнатной температуре в присутствии 0,1% тритона Х-100 в течение 2-3 мин для нарушения целостности клеточной мембраны. Затем в али- квоте определяют концентрацию хлорофилла (ХЛ) в 80%-ном ацетоне для вычисления величины фотосинтетчиской единицы (ХЛ/РЦ).

Спектрофотометрические измерения фотоиндуцированных изменений поглощения образца проводят в анаэробных условиях. Для этого 2 мл полученной реакционной смеси помещают в кювету (1 1 см). Для создания анаэробных условий туда же вносят избыток 10 мМ /Ь-D( + )-rJ.K K03bi и 50 ед/мп глюкозооксилазы (Sigma) из расчета, что 1 ед глюкозоокси, кШ 1 окисляет

1

00 00

1 мкМ (+)-глюкозы с одновременным поглощением 22,А мкл , Для разложения образовавшейся на HjO и 0 одновременно вносят 1000 ед/мл каталазы из расчета, что 1 ед каталазы разлагает 1 мкМ . в 1 мин. Образовавшийся 0 вновь поглощается глюкооксидазой. Через 30 - АО с после окончания реакции создания анаэробных условий проводят спек трофотометрические измерения фотоин- дукцированных изменений поглощения образца (ЬА) при 685 нм, связанных с фотовосстановлением феофитина. Изменения uA феофитина при 684 нм проводят на двухлучевой фосфороскопи- ческой установке. Мощность зондирующего света 50 эрГ СМ с действующего света 2,8-10 эрг-см X . Точность измерения составляет-10 ед. оптической плотности. Концентрацию феофитина вычисляют по формуле Бугера-Ламберта-Бера (D E C L), коэффициент экстинкции для феофитина при 685 нм составляет 0,32-10 .

Полученные результаты представлены в табл.1 .

мощность

Пример 2 . Хлоропласты вьще- ляют из 10-14-дневных проростков гороха на холоду при () С. Для этого 50 г листьев разрушают в гомогенизаторе (MPW-324) в течение 2 - Зев среде, содержащей 0,35 М NaCl, 0,02 М трис-НС буфер (рН 7,8) и 2 мг/мп аскорбата натрия. Фильтрат, полученный после отжимания массы через полотно в восемь слоев марли, центрифугируют в течение 1 мин при 1000 об/мин, осадок отбрасывают, а супернатант вновь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант (обломки хлоропластов) от- брасывают, а осадок целых хлоропластов ресуспендируют в среде,, содержащей 15 мМ трис-HCl буфер (рН 7,8) 35 1 Nad, 2 мМ MgCl . Кбнцентрацию хлорофилла определяют в 80%-ном ацетоне. Определение количества РЦ ФС-2 в хлоропластах проводят как в , примере 1.

Полученные результаты представлены в табл . 2 .

Пример 3. Выделение фрагментов хлоропластов, обогащенных ФС-2, проводят по известной методике. Хлоропласты тщательно суспендиру

5

0

5

0

5

0

0

ют Б среде,содержащей 0,07 М фосфатный буфер (рН 7,0), 0,5 М сахарозу и 0,035 М NaCl. Затем вносят в реакционную смесь 1%-ный раствор дигито- нина для разрушения хлоропластной мембраны. Затем полученную суспензию обрабатьшают на ультразвуковом дис- пергаторе УЗДН (22 кГц, 400 Вт, 1 мин), чтобы получить фрагменты хлоропластов с одинаковой степенью на- рушенности мембран и после добавления NaCl (до 2Z) инкубируют на ледяной бане при энергичном перемешивании в течение 40 мин. Гомогенат центрифугируют 15 мин при 4000xg, садок отбрасывают, а к супернатанту быстро добавляют тритон Х-100 до конечной концентрации 0,1-0,15% и вновь -центрифугируют при 20000xg в течение 45 мин. Фрагменты хлоропластов собирают и ресуспендируют в среде, содержащей 15 tM трис-HCl буфер (рН 7,8), 35 мМ NaCl и 2 мМ MgCl. Измерения проводят,как в примере 1.

Полученные результаты представлены в табл.3.

Из табл.1-3 видно, что, используя предлагаемый способ, можно определять количество РЦ ФС-2 и в целых клетках, и в хлоропластах, и в субхлоро- пластных препаратах, т.е. предлагаемый способ является универсальным.

Использование предлагаемого способа определения количества РЦ ФС-2 растений по сравнению с известным способом обеспечивает повышение точности анализа до 94-98% (по известному способу 77-78%), сокращение времени анализа до 24 мин (по известному способу 164 мин),.достижение универсальности (анализ можно проводить на целых клетках низших растений, хлоропластах и субхлоропла- стных препаратах высших растений), как следствие сокращения времени анализа достигается сохранение более высокоактивного физиологического состояния образца.

Формула изобретения

Способ определения количества реакционных центров фотосистемы-2 растений, включающий выделение хлоропластов, ресуспендирование их в буфере, определение концентрации хлорофилла с последующим спектрофо- тометрическим измерением фотоиндуцированных изменений поглощ(ния образца, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, достижения его универсальности и сокращения времени анализа, изMcpeHFip фс.тоина;. iLnpiMiaHHbtx nJMeiii - ний по ло цения образца ni oBOA- ir tr. гфедваритсльно созданных анаэробных усчовиях, а количество реакилонных цент-ров определяют по феофитину.

Таблица 1

Изобретение относится к физиологии фотосинтеза растений и может быть использовано в исследованиях пигментного аппарата фотосистемы-2 растений. Цель изобретения - повышение точности способа, достижение его универсальности и сокращение времени анализа. Для этого в анаэробных условиях проводят спектрофотометрические измерения фотоиндуцированных изменений поглощения образцов, приготовленных из целых клеток низких растений, или образцов хлоропластов и субхлоропластных препаратов высших растений, причем в качестве показателя количества реакционных центров фотосистемы-2 используют количество феофитина - промежуточного акцептора фотосистемы-2. 1 табл.

Целевые клетки

Таблица 2

Таблица 3