Способ выделения реакционных центров фотосистемы 2 растений Советский патент 1992 года по МПК A01G7/00 

Изобретение относится к биохимии и физиологии растений, а именно к способам выделения, очистки и концентрирования реакционных центров (РЦ) растений, и может быть использовано в исследованиях структурно-функциональной организации Р Ц фотосистемы 2 (ФС-2).

Известен способ выделения комплекса- РЦ ФС-2, состоящего из пяти полипептидов: 47,43,32,30 и ЮкДа.

Известен способ выделения реакционных центров,ФС-2 растений, заключающийся в двухкратном экстрагировании хлоропластов 30 мМ октилглюкозидом в присутствии 2 мМ трис-Малеата с последующим центрифугированием второго экстракта при 110000 g в течение 16ч при.4°С в градиенте плотности сахарозы (10-30%),

содержащей 30 мМ октилглюкозида, 0,75 М ЭДТА и 2 мМ трис-Малеата (.0),

Однако получаемый препарат не является РЦ, т.е. он значительно загрязнен антенной (полипептид 47 кДа) и дает низкий выход непосредственно по РЦ ФС-2 (белки Д-2, Д-1 и Ьб59 не разрешаются при ПААГ- электрофорезе).

Наиболее близким техническим решением является способ выделения РЦ ФС-2 растений, включающий солюбилизацию субхлоропластных фрагментов ФС-2 тритоном Х-100, хроматографическое разделение супернатанта на DEAE-650S, промывку колонки 30 мМ NaCI и 0,2% тритоном Х-100 для удаления основной массы (98%) сопутствующего хлорофилла, элюирование РЦ 110 мМ NaCI и последующую хромаСО

XI ел

4

тографйческую дрочистку и концентрирова-Таким образом, при нанесении солюбиние препарата.лизованных компонент субслоропластных

Недостатками способа являются.препаратов ФС-2 на колонку с иммобилизоНизкий выход РЦ ФС-2.ванным на агарозе соединением N происхоИз 50 мг (по хлорофиллу) исходных суб-5 дит и разделение, и одновременная очистке

хлоропластных фрагментов ФС-2 послекомплекса РЦ ФС-2, а также его концентрипервого хроматографирования получаютрование.

всего 2 мл загрязненных разбавленных РЦАбсорбированный на колонке комплекс

ФС-2, т.е. 1,6-2,0 мг РЦ ФС-2 (по хлоро-РЦ ФС-2 элюируют 1ЯО мМ NaCt.

филлу).10 Иммобилизацию соединения N на агаНедостаточная чистота РЦ ФС-2, пол-розу проводят по известной методике. При:

ученных после первого хроматографирова-готовленный сорбент вносят в

ния.хроматографическую колонку (1x3 см) и

Необходимость последующих хрома-уравновешивают 50 мМ трис-НС1(,2),

тографических доочистки и концентрирова-15 содержащим 0,05% тритона.Х-100 и 35 мМ

ния.NaCI.

Собранные после нескольких (как мини-Пример 1. Подготовку солюбилизиромум трех) отдельных выделений, фракцииванных компонент ФС-2 и хроматографиРЦ ФС-2 объединяют, разбавляют в 4 раза,рование солюбилизированного материала

наносят на DEAE-650S. промывают 2 ч 3020 проводят по известному способу за исклюмМ NaCI и элюируют 110мМ NaCI.чением того, что в качестве хроматографичеДаже после этого полученный препаратского носителя используют соединение N.

РЦ ФС-2 загрязнен свободным сопутствую-иммобилизованное на агарозе.

щим хлорофиллом (количество хлорофиллаПри нанесении на колонку смесь солюа на РЦ составляет 5-6 молекул).25 билизированных компонент ФС-2 контроСпособ требует значительных затратлИруют на наличие РЦ ФС-2 по величине

времени (около 30 ч).изменения поглощения (Д А) при 678 нм,

И, как следствие, полученные РЦ ФС-2связанного с фотоокислением хлорофилла

имеют низкую фотохимическую активность,РЦ ФС-2-Лево до Лево в присутствии 5 мМ

обусловленную длительным временем вы-30 .силикомолибдата натрия. На колонку наноделения, недостаточной чистотой препара-сят смесь солюбйлизированных компонент

та, высоким отношением тритонРЦ ФС-2 50мг по хлорофиллу, содержащую

Х-100/хлорофилл.,9 101в РЦ ФС-2. Затем колонку проЦель изобретения - повышение выходамывают проточным буфером в течение 1,5 ч и чистоты препарата, а также сокращение35 до получения практически бесцветного элю- времени анализа,ата. Выходящий из колонки элюат также

Поставленная цель достигается тем, чтоконтролируют на наличие РЦ ФС-2 (ДА

хроматографическое разделение, очистку.Л Лево). Далее колонку подвергают действию

концентрирование реакционных центровлинейного градиента NaCI, причем начальпроводят одновременно, причем в качестве40 ная концентрация NaCI составляет 35 мМ.

хроматографического сорбента используютПри этом элюируется всего одна хлорофил4- бензоилоксибис- трифторметил)метил1-2,лсодержащая фракция и данная фракция

6-динитрофенилгидразин, иммобилизо-проявляет фотохимическую активность, хаванный на агарозе, а элюирование РЦ-2рактерную для РЦ ФЦ-2.(Д А Петв), причем

проводят при концентрации NaCI, равной45 элюирование этой хлорофйллсодержащей

170-180 мМ.фракции начинается при концентрации

Известно, что соединение 4-{бенэо-NaCI, равной 170 мМ и достигает максиилоксибис-(трифторметил)метил -2,6-дини мального значения при концентрации NaCI,

трофенилгидразин (N) используется в каче-раиной 180 мМ.

стве гербицида или регулятора роста расте-50 С целью дальнейшей идентификации

ний.хлорофиллбелковсй фракции измеряют

Нами экспериментально установлено.спектр ее поглощения на спектрофотометчто соединение N, иммобилизованное наре, а также дифференциальный спектр поагарозе, способно связывать только комп-глощения - на фосфороскопической

леке, состоящий из полипептидов Д-1.Д-2 и55 установке.

цитохрома Ь55в, т.е. РЦ ФС-2. Измеренные спектры поглощения и

.Полипептиды 47, 43 кДа, свободныйдифференциальный спектр, полученной

хлорофилл и др. компоненты, входящие впредлагаемым способом фракции, хорошо

состав ФС-2, не связываются с соединени-совпадают со спектром РЦ ФС-2 , ем N.

П р и м е р 2. Одновременно для контроля на специфичность связывания РЦФС- 2 с соединением N проводят хроматографирование смеси солюбилиэи- рованных компонент ФС-2 на а га розе без соединениям.

Супернатант солюбилизированных препаратов ФС-2 получают как в примере 1 и наносят на колонну с активированной ага- розой без соединения N. Хроматографиру- ют как в примере 1. При промывке промывочным буфером колонка отмывается полностью до совершенно бесцетных фракций.

Контроль на присутствие фотохимиче ской активности, характерной для РЦ ФС:2, проводят как в примере 1. Элюат проявляет активность по РЦ ФС-2, .сравнимую количественно с активностью исходной смеси солюбилизированных компонент РЦФС-2 до хроматографирования, т.е. не происходит связывания никаких компонентов ФС-2, в т.ч. и реакционных центров ФС-2.

П р им е р 3. Для количественного сравнения известного и предлагаемого ело собов проводят выделение РЦ ФС-2.

Подготавливают солюбилизированные компоненты и проводят хроматографирование. После первого хроматографирования на колонке с DEAE-650S получают фракцию РЦ ФС-2, содержащую дополнительные примеси свободного антенного хлорофилла. Соотношение хлорофилл/РЦ для этих препаратов составляет 8-10 молекул. Выход по РЦ ФС-2 составил 27%

Необходимо препарат доочиетить и сконцентрировать. Для этого собирают фракции РЦ ФС-2, Полученные после трех отдельных выделений (первые три отдельных хроматографирования), объединяют их, разбавляют и хроматографируют. Полученную фракцию РЦ ФС-2 используют для сравнительного анализа предлагаемого и известного способов по компонентному составу; фотохимической активности и ста- бильности При хранении; выходу РЦ ФС-2; чистоте препарата; затратам времени;

. Полипептидный состав комплексов РЦ ФС-2, полученных известным и предлагавмым способами, определяют электрофоре- тически в 12% ПААГ в присутствии 6,1% додецилсульфата натрия и 6 М мочевины.

Полипептидный состав комплексов РЦ ФС-2, полученных обоими способами, совершенно идентичен и представлен пол- ипептидами 32 кДа (Д-1). 30 кДа (Д-2) и 10 кДа (апобелок цитохрома bssg).

Таким образом, и по спектру поглощения, и по дифференциальному спектру, и по компонентному составу, препараты РЦ ФС2, полученные известным и предлагаемым способами, идентичны, кроме содержания хлорофилла на 1 РЦ.

Препараты РЦФС-2, полученные предлагаемым способом обладают фотохимической активностью - способны к фотоокислению Пеео и фотовосстановлению Фео. чистота препаратов РЦ ФС-2 (величина обратная загрязненности молекулами свободного антенного хлорофилла) выше, среднее значение соотношения хлоро- филл/РЦ для предлагаемого способа составляет 4 молекулы, для известного - 5 молекул.

Данный сравнительного анализа предлагаемого и известного способов по выходу РЦ ФС-2 и данные по контролю на специфичность 4- бензиолоксибис-(трифторме- тил)метил -2,6-динитрофенил гидразина показывают, что в предлагаемом способе выход по реакционным центрам составляет 85,5%, в известном способе - 63,1%, При использовании же а га розы %без 4- бензо- илоксибис-(трифторметил)мётил -2,6-динит- рофенилгидразина выход по РЦ ФС-2 составляет 0%.

Следовательно, только 4- бензоилокси- бие-(трифторметил)метил -2,6-динитрофен- илгидразин обладает специфичностью связывания по отношению к РЦ ФС-2.

За счет одновременного хроматографи- ческого разделения, очистки препарата и его концентрирования анализ удается провести за 5 ч 30 мин (ь прототипе - 26 ч 30 мин).

Использование предлагаемого способа выделения РЦФС-2 по сравнению с известным обеспечивает следующие преимущества: выход РЦ ФС-2 составляет 85,5% (в прототипе - 63,1%); повышается чистота препарата РЦ ФС-2, а именно количество хлорофилла составляет4 молекулы, в прототипе 5 молекул; анализ проводят в течение 5 ч 30 мин, в прототипе - 26 ч 30 мин; как следствие сокращения времени выделения повышается способность сохранять фотохимическую активность, в зависимости от количества измерений и времени хранения при 4°С в течение серии измерений.

Кроме того, достигнуто значительное упрощение методики выделения (вместо 3- 4 хроматографирований в прототипе - одно хроматографирование в предлагаемом способе); а также отпала необходимость в использовании дорогостоящих импортных химических реактивов.

Формула изобретения Способ выделения реакционных центров фотосистемы 2 растений включающий

выделение хлоропластов, солюбилизирова- ние су бхлоропластных фрагментов, нанесение субхлоропластных фрагментов на колонку с адсорбентом, промывку колонки и элюирование реакционных центров фотосистемы 2, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и чистоты, препарата, а также сокращения времени анализа, в качестве адсорбента используют 4- бензо- илоксибис-{трифторметил)метил}-2,6-динит- рофенилгидразин, иммобилизованный на а га розе, а элюирование реакционных центров фотосистемы 2 осуществляют раствором NaCI с концентрацией 170-180 ммоль.

Изобретение относится к биохимии и физиологии растений, а именно, к способам выделения, очистки и концентрирования ре-, акционных центров (РЦ) фотосистемы 2(ФС-2) растений. Целью изобретения является повышение выхода и чистоты препарата, а также сокращение времени анализа. Хроматографическое разделение, очистку и концентрирование проводят одновременно, причем в качестве хроматографического носителя используют 4-(бензоил-оксибис-) трифторметил(метил)-2,6-динитрофенилги- дразин. иммобилизованный на агарозе. а элюирование РЦ ФС-2 проводят при концентрации NaCI, равной 170-180 мм. СО С