Способ определения чувствительности растений к факторам внешней среды Советский патент 1992 года по МПК A01G7/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для оценки чувствительности растений к неблагоприятным факторам внешней среды физической или химической природы (например, повышенная или пониженная температура, пестициды и т.д.) при ускоренной ориентировочной качественной оценке большого объема исследуемого растительного материала.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения чувствительности растений к неблагоприятным факторам внешней среды.

Цель изобретения - повышение точности определения и упрощение способа.

Цель достигается тем, что согласно способу определения чувствительности растений к неблагоприятным факторам внешней среды, предусматривающему отбор тестируемых растений, разделение их на контрольную и опытную группы, воздействие фактором на растения опытной гр уппы, выделение из растений обеих групп фракций клеточной структуры, введение в них субстрата фермента и ингибитора ферментативной реакции -составление реакционных смесей, определение скорости ферментативной реакции в контрольной и опытной смесях, их сравнение и признание растения опытной группы чувствительным к фактору при уменьшении скорости ферментативной реакции в опытной смеси по сравнению с контрольной, в качестве клеточных структур используют хлоропласты, в качестве фермента - ацетилхолинэстеразу, а в качестве субстрата - ацетилхолин.

За счет отказа от нестандартного суб- страта:ферментативной реакции (эритроцитов), повышается точность определения. За счет отказа от выделения липидной фракции из растений способ упрощается.

Установлено, что ингибитор, который .образуется в растении в ответ на воздействие на негр неблагоприятным фактором, со- средоточивается в . хлоропластах.

сл

с

VI ю ю со

03

Следовательно, их можно использовать в качестве той фракции, которую вводят в реакционную смесь. Процедура выделения хлоропластов значительно проще процедуры выделения липидной фракции растений.

Установлено также, что ингибитор, который накапливается в хлоропласта/, инги- бирует активность содержащегося в них фермента - ацетилхолинэстеразы. Следовательно, хлоропласты можно одновременно использовать и в качестве фермента, вводимого в реакционную смесь. Субстратом для фермента служит ацетилхолин.

В качестве стандартной используется реакционная смесь, содержащая выделенные из обработанного растений хлоропласты, ацетилхолин и ингибитор реакции ферментативного расщепления .ацетилхолина ацетилхолинэстеразой; параллельная реакционная смесь содержит хлоропласты, выделенные из данного растения до его обработки неблагоприятным фактором, ацетилхолин и ингибитор реакции ферментативного расщепления ацетилхолина ацетилхолинэстеразой.

Чем большее количество ингибитора обнаружится в хлоропластах обработанного растения (чем больше угнетение реакции расщепления ацетилхолина наблюдается в реакционной смеси), тем более чувствительно данное растение к тому неблагоприятному фактору, которым на него воздействовали.

П р им ер 1. Из листьев гороха, используемых в контроле (без воздействия на растение повреждающего фактора) и в опыте (после воздействия на растение повышенной температуры) выделяют хлоропласты. Для выделения хлоропластов 10 г измзль- ченных листьев заливают 50 мл сахарозо- фосфатного буфера, рН 7,25 (сахароза 0,3 М, KCI 0,05 М. MgCIa 0,01 М, альбумин 0,5%). Полученную смесь растирают 1-2 мин при 1-4°С, растертую массу отжимают через 6 слоев батиста и центрифугируют 3 мин при н-4°С при 4000 об/мин. Осадок ресуспенди- руют в растворе, содержащем 0,5 М сахарозы и 0,05 KCI, суспензию центрифугируют 2 мин при +4°С при 4000 об/мин, осадок ре- суепендируют в 0,05 М трис-KCI буфера без сахарозы и суспензию выдерживают 30 мин при 1-4°С. Полученную суспензию выделенных хлоропластов вводят в реакционную смесь, которая содержит 0,1 М К-фосфатный буфер, рН 7,4, и ацетилхолиниодид. Готовят серию реакционных смесей, в которых в каждой из последующих смесей концентрация ацетилхолинаиодида на 0,2 мМ больше, чем в предыдущей. Таким образом, приготовлено.5 реакционных смесей, содержащих соответственно 0,2; 0,4; 0.6; 0.8 м 1 мМ ацетилхолина, обьем 0,1 мл. В каждой реакционной смеси содержатся хлоропласты в количестве органелл/мл (хлорофилл 0,12-0,15 мг/мл). Объем смеси составляет 50 мл. Реакцию осуществляют при 27°С В каждой из полученных смесей осуществляется реакция гидролиза ацетилхо- линиодида в отсутствии ингибитора

(контроль).

Параллельно готовят такую же серию реакционных смесей, в каждую из которых вводят по 0,4 мМ хлорофоса - ингибитора реакции ферментативного гидролиза ацетилхолина (опыт), затем такую же серию реакционных смесей с введением в них по 0,6 мМ хлорофоса (опыт), затем - с добавлением 0,8 мМ хлорофоса (опыт). Смеси ингибируют по 2 мин. За ходом реакции следят по выделению протонов, которые регистрируют по- тенциометрическим методом (изменение величины рН), Полученные данные.откладывают по оси ординат, а на оси абсцисс - время протекания реакции. Вычерчивают

график зависимости величины рИ реакционной смеси от продолжительности ее ингиби- рования и находят iga (угла наклона полученной кривой к оси абсцисс), который служит условной единицей, по которой судят о скорости ферментативной реакции в данной реакционной смеси.

Экспериментальные данные скоростей реакции для различных концентраций аце- тилхолиниодида в контроле (без хлорофоса)

и в опыте (при ингибировании реакции хлорофосом) представляют в координатах Ла- нуйвера-Берка (обратной скорости гидролиза ацетилхолина от его обратной концентрации). Это позволяет оценить кинетические параметры: константу Михаэли- са,. максимальную скорость реакции, константу ингибирования в опыте и о контроле.

Константа ингибирования

До

1 Wo/Wi - 1 3

гдеЭо - начальная концентрация ингибитора;

Wo максимальная скорость реакции в

контроле;

Wi - максимальная скорость реакции в опыте.

Скорость реакции ферментативного гидролиза снижается под действием ингибитора хлорофоса. Но угнетение, скорости этой реакции становится еще более выраженным, если в реакционную смесь вводят хлоропласты из растения, подвергнутого действию неблагоприятного фактора.

П р и м е р 2. По методике по примеру 1 провели исследования жаростойкого сорта гороха к термическому воздействию.

Данный сорт не образует ингибитора о ответ на воздействие на него термического фактора.

Пример 3. По предлагаемому способу оценили устойчивость трех сортов гороха к неблагоприятным факторам (см. таблицу).

Приведенные в таблице данные свидетельствуют о том, что образец III является наиболее устойчивым к повреждающим факторам, гак как Ki 0,88 мМ по сравнению с образцом I Ki 0,66 мМ, т.е. образец III - более термостойкий, чем образец I.

Формула изобретения

Способ определения чувствительности растений к факторам внешней среды, предусматривающий отбор тестируемых растений, разделение их на контрольную и опыт- . ную группы, воздействие фактором на растения опытной группы, выделение из растений обеих групп . фракций клеточной

структуры, введение в них субстрата фермента и ингибитора ферментативной реакции - составление реакционных смесей, определение скорости ферментативной реакции в контрольной и опытной смесях, их

сравнение и признание растения опытной гурппы чувствительным к фактору при уменьшении скорости ферментативной реакции в опытной смеси по сравнению с кон- тролбНой, отличающийся тем, что. с

целью повышения точности определения и упрощения способа, в качестве клеточных структур используют хлоропласты, в качестве фермента -ацетилхолинэстеразу. а в качестве субстрата - ацетилхолин.

Изобретение относится к сельскому хо зяйству, и м.б. использовано для определения чувствительности растений к факторам внешней среды. В качестве тест-структуры растений используют хлоропласты. Критерием чувствительности является скорость ферментативной реакции при наличии субстрата фермента и ингибитора ферментативной реакции. В качестве фермента используют ацетилхолинэстеразу, в качестве субстрата - ацетилхолин. 1 табл.