Способ оценки морозоустойчивости сортов озимой пшеницы Советский патент 1989 года по МПК A01H1/04 A01G7/00 

Изобретение относится к области физиологии растений и может быть использовано при лабораторной диагностике на зимостойкость больимх наборов сортов и гибридов озимой пшеницы для целей селекции.

Цель изобретения - снижение трудоемкости, повышение массовости анализов и ускорение процесса оценки.

Способ основан на том, что используют белки-маркеры, по количественному содержанию которых, можно судить о степени морозоустойчивости разных сортов пшеницы. В качестве таких маркеров используют два белка антигена с -электрофоретиче- ской подвижностью 0,24 и 0,30, полученных дпумерним пммуноэлектрофоре- зом.

Разница в размерах и интенсивно- ности дуг преципитации одинаковых по подвижности антигенов в препаратах контрольных и охлажденных растений обусловлена изменениями в количестве отдельных белковых- компонентов. В частности, если у неохлажденных растений явно вьфажено количественное преобладание антигена с подвижностью Rf 0,24 над антигеном с Rf 0,30, то у охлажденных растений наоборот преобладает пик антигена Rf 0,30. Это обуславливается уменьшением высоты дуги Rf 0,24 и увеличением антигена Rf 0,30. Причем, даже неохлажденные 3-дневные проростки озимой пшеницы морозоустойчивых сортов содержат больше антигена Rf 0,30. Чем более морозоустойчивый сорт, тем выше содержание бел

СО

00 00 4

31А9

ка с Rf 0,30 и ниже со ч-М жание белка Rf 0,2ii, и наоборот, В качестпс оценки берется линейная высота дуг пре- Щ1питаиии белк;1В с рассмотренной электр1- форетическ(;й подвжиностью . За 100% усто1 чивости используют высоту дуг преципитации антигенов известной морозоустойчивой озимой пшеницы Лл бидум 11,

Способ осущест1,: лется следующим образом.

Лля проведения двумерного (перекрестного) иммуноэлектрофореза 4 г этиолиронанных проростков, выращен- ных в тече}1ие 3 сут. при 28 С,растирают в xo.n(, iH(M i комнате в 10 мл барбитал-ацетатного буфера с рИ 8,6, с(Я1ержащего 0,01 М меркаптоэтанола, Гомогенат центрифугируют при 20000 g в течение 15 мин. Для электрофореза используют бесклегочный экстракт, В1,гравненный по белку, который наносят в лунки на залитой на предметное стекло агарозы. В качестве cBitn,e- теля используют бромфеноловый синий Электрофорез проводят при силе тока 100-120 мЛ и напряжении 80 В в течение 1,3-2 ч, по мере выхода свидетеля на противоположный край стек- ла. П(ч-:,ле одномерного электрофореза две полоски с раздеутенными белковы -Я образцами помешают на стеклянную пластинку размером 4,5x12 см и оставшуюся часть пластинки заливают 12 мл раствор,-) агарозы, содержащей антитела (10 NLn 1%-ной агарозы в барбитал- ацетчтном буфере с рН 8,6 + 2 мл буфера , содержащего 350 мг лиофильно высушенного глобулина). Перекрестный иммуноэлектрофорез ведут при силе тока 40 мЛ и напряжении 40 В в течение 24 ч. После окончания иммуно- электрофореза препарат отмывают от непрореагировавших белков сменой физиолог ичес кого раствора, высуип ва- ют, oKpaiiniBtiHiT, а}гализируют высоты пик(.1В билков с подвижностью Rf 0,24 и 0,30 и оиенирают степень морозо- ycToi 4HBot; ги .

Получение высушенного глобулина осуществляют следуы11Д1м путем.

Используют этиолированные проростки 1П1 еницы. Растительный материал вырашинакп на влажной фильтро- валыюй 6y:-iare в 1ермостате при 28 С в Tfc ii ime 3 сут. Температурную обработку iipiMio;; н течение 1 ч при -4 С. i;i:6frn пшенищ, измельча

0 5 0 r

0

5

ют в ступке с жидким азотом, а белки экстрагируют одним объемом О, 15М NaCl в фосфатном буфере 0,1 М (рН 7,4), содержащего 0,01 М меркаито- зтанола. Структу11ные элементы кле- 1ОК осаждают центрифугированием при 20000 g в течение 15 -гин. Высокомолекулярные соединения из суперна- танта, используемые в дальнейшей работе, отделяют от низкомолекулярньгх веществ на колонке с сефадексом F-25 и лиофильно высушивают.Белковые препараты, полученные из охлажденных растений, используют для получения антисывороток. С этой целью антигены смешивают с дополнителен Фрейнда и подкожно вводят кроликам. В первом цикле (в три приема с не- дел ьными интерва аами) вводят примерно по 75 мг белка, а при реиммуни- зации через месяц - по 40 мг белка. Через 10 дн. после реиммунизации берут кровь из краевой ушной вены, отделяют сыворотку, высаливают гамма-глобулиновую фракцию сульфатом аммония (50% насыщения), диали- зуют против дистиллированной воды и лиофильно сушат.

Формула изобретения

Способ оценки морозоустойчивости сортов озимой пшеницы, включающий предварительное проращивание в лабораторных условиях семян исследуемых сортов и сортов с известной морозоустойчивостью до стадии проростков и измерение у них биохимических показатепей, по значению которых у исследуемых сортов при сравнении tfx с показателями образцов с известной морозоустойчивостью оценивают последнюю, отличаюп1:ийся тем, что, с целью снижения трудоемкости, повьшения массовости анализов и ускорения процесса оценки, измерение осуществляют на 3-суточ- ных проростках, а качестве биохимического показателя используют белки, выявленные двумерным иммуноэлек- трофорезом против антител на белки морозоустойчивой пшеницы и по высоте пиков белков с подвижностью Rf 0,24 и 0,30 оценивают степень морозоустойчивости, при зтом чем более морозоустойчивый сорт, тем выше содержание белка с Rf 0,30 и ниже содержание белка с Rf 0,24.

Изобретение касается физиологии растений и может быть использовано при лабораторной диагностике на зимостойкость больших наборов сортов и гибридов озимой пшеницы для целей селекции. Цель изобретения - снижение трудоемкости, повышение массовости анализов и ускорение процесса оценки. Семена исследуемых сортов и сортов с известной морозоустойчивостью проращивают при 28°С в течение 3 сут. Из проростков методом двумерного иммуноэлектрофореза выявляют белки против антител на белки морозоустойчивой пшеницы. По высоте пиков белков с подвижностью RF 0,24 и 0,30 оценивают степень морозоустойчивости, при этом чем более морозоустойчивый сорт, тем выше содержание белка с RF 0,30 и ниже содержание белка с RF 0,24.