СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ СОРТОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ Советский патент 1994 года по МПК A01G7/00 

Изобретение относится к физиологии растений и может быть использовано при диагностике на холодоустойчивость больших наборов сортов и генотипов озимой пшеницы для целей селекции.

Цель изобретения - снижение трудоемкости, повышение надежности определения и его ускорение.

На чертеже представлена схема постановки двойной иммунодиффузии через барьер, где 1 - раствор белка; 2 - барьерная сыворотка; 3 - проявляющая сыворотка; 4 - линии преципитации белков, прореагировавших с барьерной сывороткой; 5 - линия преципитации антигена, прореагировавшего с проявляющей сывороткой.

Способ основан на том, что в качестве маркеров используют антигены, по содержанию которых в белке судят о степени морозоустойчивости сорта озимой пшеницы.

В качестве таких маркеров используют два количественно преобладающих антигена. Высокое содержание первого характерно для высокоморозоустойчивых генотипов растений, второго- для низкоморозоустойчивых генотипов. Первый антиген проявляется сывороткой на белки проростков растений высокоморозоустойчивых генотипов озимой пшеницы (в процессе роста содержание его в растении снижается) и содержание его еще более увеличивается под действием низкой температуры, поэтому для его проявления используется сыворотка на белки трехсуточных проростков пшеницы сорта Альбидум 24, подвергнутых холодовому воздействию -4^оС в течение 1 ч. Второй антиген проявляется сывороткой на белки активновегетирующих одномесячных растений, поскольку содержание этого антигена исходно низкое, в процессе роста и развития растения постоянно увеличивается и к этому возрасту достигает высокого уровня, поэтому для его проявления используется сыворотка на белки одномесячных растений пшенично-пырейного гибрида ППГ 829.

Для выявления этих антигенов-маркеров используют метод двойной иммунодиффузии через барьер. Принцип метода иммунодиффузии через барьер состоит в том, что белок, внесенный в лунку в слое агара в виде раствора, диффундирует в агаре и реагирует с диффундирующей из двух лунок барьерной сывороткой. В качестве барьерной сыворотки используют сыворотку на белки проростков низкоморозоустойчивого сорта, поскольку эта сыворотка имеет низкий титр антител на оба этих антигена (в качестве барьерной сыворотки используют сыворотку на белки трехсуточных проростков пшеницы сорта Скала). При реакции белка с барьерной сывороткой выпадают в преципитат все остальные антигены, имеющиеся в суммарном белке, и часть антигенов, но часть этих двух антигенов в результате истощения барьерной сыворотки пробивает барьер. По другую сторону барьера находится лунка с проявляющей сывороткой (сывороткой на белки пшеницы сорта Альбидум 24 для первого антигена и белки ППГ 829 для второго антигена). Пробившие барьер антигены преципитируют с проявляющей сывороткой, в результате чего образуется ясно видимая опалесцирующая линия преципитации.

Сущность предложенного способа состоит в том, что для определения морозоустойчивости проводят одновременную диффузию ряда разведений исходного белкового раствора. При этом отмечают последнее разведение белкового раствора, на котором интересующий нас антиген пробивает барьер и реагирует с проявляющей сывороткой. Предварительно определяют содержание белка в исходном белковом растворе и после проведения диффузии рассчитывают количество белка в лунке с отмеченным разведением. Одновременно проводят диффузию двух партий постановок иммунодиффузии: в первой партии проявляющей сывороткой является сыворотка на белки пшеницы сорта Альбидум 24 и определяется первый антиген, во второй - сыворотка на белки ППГ 829 и определяется второй антиген.

При определении морозоустойчивости берут отношение содержания первого антигена к содержанию второго. Для этого количество белка (в мкг) в лунке, в которой происходит последний пробой антигена, проявляемого сывороткой на белки ППГ 829, делят на количество белка в лунке, в которой происходит последний пробой антигена, проявляемого сывороткой на белки пшеницы сорта Альбидум 24. Полученную для исследуемого сорта величину сравнивают с величиной, определенной при анализе контрольного сорта с известной зимостойкостью.

Сопоставительный анализ с известным способом показывает, что способ определения морозоустойчивости растений отличается от известных тем, что он не требует сложных и дорогостоящих приборов и позволяет проводить анализы в необходимом для статистической достоверности числе повторностей.

Способ осуществляется следующим образом.

В работе используют этиолированные проростки озимой пшеницы. Растительный материал выращивают на влажной фильтровальной бумаге в термостате при 28^оС в течение 3 сут. Побеги пшеницы измельчают в ступке с жидким азотом и белки экстрагируют одним объемом 0,15 М NaCl в фосфатном буфере 0,1 М (рН 7,4), содержащего 0,01 М меркаптоэтанола. Структурные элементы клеток осаждают центрифугированием при 20000 q в течение 15 мин. Высокомолекулярные соединения из супернатанта, используемые в дальнейшей работе, отделяют от низкомолекулярных на колонке с сефадексом Г-25 и лиофильно высушивают. Белковые препараты, полученные из растений сортов Скала, Альбидум 24 и ППГ 829, используют для получения сывороток. С этой целью антигены смешивают с дополнителем Фрейнда и подкожно вводят кроликам. В первом цикле (три приема с недельными интервалами) вводят по 75 мг белка, а при реиммунизации через месяц - по 40 мг белка. Через 10 дней после реиммунизации берут кровь из краевой ушной вены, отделяют сыворотку, высаливают гамма-глобулиновую фракцию сульфатом аммония (50% насыщения), концентрируют и растворяют в 0,15 М NaCl. Измерение содержания антигенов проводят методом двойной иммунодиффузии через барьер. Для этого на стеклянной пластинке размером 6 х 9 см наносят слой расплавленного агара, приготовленного на 0,15 М NaCl. В застывшем слое агара с помощью трафарета пробиваются лунки согласно схеме чертежа. В лунке для создания барьера с помощью дозатора вносят по 75 мкл барьерной сыворотки, в лунки для проявляющей сыворотки - по 75 мкл проявляющей сыворотки, а в лунки для белка - по 50 мкл раствора белка (с разведениями от исходного до 1: 7). Стеклянные пластинки помещают в чашки Петри и ставят в холодильник на 2 - 3 сут для прохождения иммунодиффузии. Содержание белка в исходном белковом растворе предварительно определяют по методу Лоури. После окончания иммунодиффузии рассчитывается количество белка в лунке для разведений, на которых произошел последний пробой барьера каждым из антигенов и рассчитывается отношение пробоя антигена, проявляемого сывороткой на белки ППГ 829, к пробою антигена, проявляемого сывороткой на белки пшеницы Альбидум 24. Полученная для исследуемого генотипа величина сравнивается с величиной, полученной для сорта с известной морозоустойчивостью, взятого за эталон (в данном случае сорта Безостая). Чем выше у исследуемого генотипа эта величина, тем более морозоустойчив этот генотип (см. таблицу).

Сравнение высокоморозоустойчивых генотипов 155 и 160 и низкоморозоустойчивых генотипов 172, 157, 51 со среднеморозоустойчивым сортом Безостая, взятым за эталон.

Наиболее холодоустойчивый генотип - 155, за ним следуют 160, Безостая - эталонный сорт, 51, 172 и 158.

Техническое решение обеспечивает выявление белков-маркеров, обусловливающих устойчивость растений к низким температурам. Измерение содержания этих белков может быть использовано при диагностике большого числа сортов и гибридов озимой пшеницы для селекции на морозостойкость. Использование способа на селекционных станциях дает возможность сократить сроки и повысить надежность селекции сортов озимой пшеницы.

(56) Авторское свидетельство СССР N 1494884, кл. А 01 G 7/00, 1987.

Изобретение относится к физиологии растений и может быть использовано при диагностике на холодоустойчивость больших наборов сортов и генотипов озимой пшеницы для целей селекции. Цель - снижение трудоемкости, повышение надежности определения и его ускорение. Проращивают семена исследуемых сортов. Получают белковые экстракты из проростков и осуществляют постановку иммунотеста полученного белкового экстракта с сывороткой на белки морозоустойчивого сорта. В качестве иммунотеста используют реакцию двойной иммунодиффузии через барьер с применением трех сывороток, две из которых - проявляющиеся на белки проростков высокоморозоустойчивого сорта озимой пшеницы, стрессированных при отрицательной температуре, и белки одномесячных активновегетирующих растений, и одна барьерная - на белки проростков низкоморозоустойчивого сорта. Оценку осуществляют по отношению количества белка, при котором происходит взаимодействие белкового экстракта через барьерную сыворотку с проявляющей сывороткой на белки активновегетирующих растений, к количеству белка, при котором происходит взаимодействие белкового экстракта через барьерную сыворотку котором происходит взаимодействие белкового экстракта через барьерную сыворотку с проявляющейся на белки пшеницы высокоморозоустойчивого сорта, при этом чем выше величина отношения, тем более морозоустойчив сорт. 1 ил.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ СОРТОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ, включающий проращивание семян исследуемых сортов, получение белкового экстракта из проростков, постановку иммунотеста полученного белкового экстракта с сывороткой на белки морозоустойчивого сорта и последующую оценку по результатам иммунотеста, отличающийся тем, что, с целью снижения трудоемкости, повышения надежности определения и его ускорения, в качестве иммунотеста используют реакцию двойной иммунодиффузии через барьер с применением трех сывороток, две из которых, проявляющиеся на белки проростков высокоморозоустойчивого сорта озимой пшеницы, стрессированных при отрицательной температуре, и белки одномесячных активновегетирующих растений, и одна барьерная - на белки проростков низкоморозоустойчивого сорта, а оценку осуществляют по отношению количества белка, при котором происходит взаимодействие белкового экстракта через барьерную сыворотку с проявляющей сывороткой на белки активновегетирующих растений, к количеству белка, при котором происходит взаимодействие белкового экстракта через барьерную сыворотку с проявляющейся на белки пшеницы высокоморозоустойчивого сорта, при этом чем выше величина отношения, тем более морозоустойчив сорт.