Способ определения уровня морозоустойчивости озимой пшеницы Советский патент 1993 года по МПК A01G7/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции озимой пшеницы.

Общеизвестно, что в районах культурного земледелия периодически происходит гибель посевов озимой пшеницы под влиянием низких зимних температур. Связанная с этим явлением необходимость весеннего пересева вымерзших площадей яровыми культурами наносит народному хозяйству ощутимый экономический ущерб.

С тем. чтобы уменьшить риск зимней гибели озимой пшеницы, селекционеры издавна работают над повышением уровня ее морозоустойчивости. Одним из обязательных компонентов работы в этом направлении является экспериментальное определение устойчивости к низким отрицательным температурам селекционного материала.

Наиболее надежные и хорошо воспроизводимые результаты получают в результате промораживания в морозильных камерах

оо ю ю о о о

растений при отрицательных температурах, близких к критическим значениям, Однако использование такого способа требует наличия специального оборудования, площадей для отращивания промороженных растений и др., т.е. экономически явно не выгодно, так как связано с большими затратами, включая затраты энергетического характера.

По этой причине специалисты в области физиологии растений предпринимают настойчивые попытки разработать косвенные методы определения морозоустойчивости озимых культур, не связанные со столь значительными затратными механизмами.

Исследовательскую деятельность в этом направлении нельзя назвать безуспешной, так как к настоящему времени благодаря предпринятым усилиям создан ряд косвенных методов определения уровня морозоустойчивости озимых культур. К их числу относятся и немногочисленные подходы к разработке ферментативных способов. Так, авторы одной из научных разработок считают, что повышенная активность дегид- рогеназ после закаливания озимой пшеницы может служить одним из показателей ее морозоустойчивости.

В качестве прототипа может служить описание определения морозоустойчивости на основе анализа активности-фруктофура- нидазы у растений.

Однако как эти, так и иные научные разработки, основанные на определении активности ферментов в процессе охлаждения растений, отличаются тем недостатком, что они сложны по своему выполнению, требуют для своего осуществления высокой квалификации испопнителей, а главное, дают результаты, недостаточно надежно воспроизводимые и точные. Указанные недостатки не позволяют широко использовать известные ферментативные способы для оценки селекционного материала на морозоустойчивость. Положительное их значение заключается в расширении существующих познаний о природе свойства морозоустойчивости озимых и, что важнее, в обоснованности дальнейших поисков более тесной взаимосвязи между морозоустойчивостью и функциональной деятельностью ферментов, играющих ключевую роль в жизнедеятельности растений.

Известно, что рост - один из процессов, в первую очередь реагирующих на изменение температуры, а ключевым ферментом, регулирующим интенсивность этого процесса, является ИУК-окспдаза, которая вызывает ингибирование функциональной

деятельности ростстимулирующего гормона - ИУК. Это обстоятельство обрело черты новой идеи использования ИУК-оксидазы в качестве показателя уровня морозоустойчивости озимой пшеницы.

Возникшая идея сделала возможным выдвинуть задачу разработки лабораторного экспрессного способа, который бы отвечал требованиям ускорения и повышения

точности определения морозоустойчивости озимой пшеницы и упрощения его осуществления по сравнению с существующими ферментативными способами. В качестве показателя, характеризующего уровень ус5 тойчивости озимой пшеницы к нцзким температурам, фигурировала величина активности рострегулирующего фермента - ИУК-оксидазы.

Пример осуществления способа. Для

0 получения опытных проростков семена озимой пшеницы проращивали в песчаной культуре при 20°С и 16-часовой длине дня в течение 5, 7, 10 и 15 суток. Питательным субстратом служил разведенный вдвое рас5 твор Арнона-Хогланда. Равновозрастные проростки по классической методике подвергали первой фазе закаливания при 2°С и круглосуточном освещении в течении 5 дней и далее второй фазе закгливания при -2°С в

0 темноте также 5 суток.

Объектом исследования служили сорта озимой пшеницы, обладающие неодинаковой морозоустойчивостью: Одесская 16, Ульяновка (высокая), Одесская 51, Миронов5 екая 808 (выше средней), Обрий, Безостая 1, Спартанка. Грана (средняя), Сан-Пасторе, Русалка (низкая).

Ферментную вытяжку с ИУК-оксидаз- ной активностью получали по методике Гам0 бурга из навески свежей ткани надземной части проростков 1г, которую растирали в охлажденной ступке с 10 мл 0,02 М фосфатного буфера рН 6,1. После 30-минутной экспозиции в холодильнике гомогенат

5 центрифугировали при 8 тыс об/мин в течение 10 мину г. Для отделения ферментной вытяжки от ингибиторов эндогенной природы использовали гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-25. Первые 2,5 мл

0 элюата отбрасывали, а следующие 6 мл собирали для определения ЙУК-оксидазной активности.

С этой целью готовили реакционную смесь(1 мл раствора 2,4-дихлорфенола, 1 мл

5 раствора MnCI. 2 мл раствора ИУК, 4 мл 0,02 М фосфатного буфера и 2 мл ферментной вытяжки), прокачивали ее на лабораторной качалке в темноте при 26°С. Далее отсюда через 10, 20, 30, 40 и 60 мин отбирали по 1 мл реакционной среды и переносили в пробирку с 2 мл реактива Сальковского. Окраска здесь развивается в течение 60 минут. Перед началом колориметрирования пробирки центрифугировали при 1 тыс об/мин в течение 5 минут.

Колориметрирование проводили на фотоколориметре при зеленом светофильтре (максимум пропускания при 490 ммк). По полученным отсчетам строили кривую динамики разрушения ИУК. Для рассчета фер- ментатипной активности использовали весь прямолинейный участок кривой, т.е. тот отрезок времени, в течение которого разрушение происходило с постоянной скоростью. Рассчет активности проводили по соответствующей формуле.

Проведенные исследования показали (табл.1), что контрольные растения, по подвергавшиеся закаливанию, после выращивания при 20°С и 16-часовой /унте дня не обнаруживали дифференциацию по признаку морозоустойчивости. При этом никакой закономерной связи между активностью ИУК-оксидззы и уровнем морозоустойчивости не было отмечено у опытных ррстений разного возраста.

Это обстоятельство не вызывает удивления, так как давно известно, чго свойство морозоустойчивости проявляется только после охлаждения (закаливания) растений, подавления роста, перестройки регулятор- но-метаболических систем н направлении развития защитных физиологических механизмов, которые позволяют им выжить при последующем воздействии низких отрицательных температур. Активно вегетирую- щие растения даже наиболее морозоустойчивых сортов но способны сопротивляться иоздейстиню морот. По этой причине подавляющее большинство методов определения уровня морозоустойчивости озимых культур основано нл анализе тех или иных физиологических показателей у предварительно прошедших закаливание растений. Обработка опытных растений пониженной температурой (-2°С) при круглосуточном освещении в процессе прохождения ими первой фазы закаливания семисуточной продолжительности не привела к выявлению урозня морозоустойчивости у исследуемых сортов озимой пшеницы по величине активности ИУК-оксидэзы (табл.2).

Корреляция между активностью ИУК- оксидазы и морозоустойчивостью при этом не проявлялось у проростков разного возраста (от 5 до 15 суток). Исключение составлял лишь очень морозоустойчивый сорт Одесская 16, разновозрастные проростки которого обладали достоверно наиболее высокой активностью фермента.

Однако этого, бесспорно заслуживающего внимания факта, недостаточно для со- 5 здания действенной системы оценки морозоустойчивости озимой пшеницы, так как сорта с разным уровнем устойчивости, но меньшей, чем у сорта Одесская 1 б. нивелировались.

0 Результаты определения активности ИУК-оксидазы после прохождения разновозрастными проростками второй фазы закаливания при -3°С в темноте в течение трех суток оказались неоднозначными. Так, у пя5 ти- и десятисуточных проростков активность Фермента не отражала уровень морозоустойчивости сортов, У 15-суточных проросiков проявлялась некая тенденция возможности суждения об уровне морозо0 устойчивости сортов по активности фермента. Во r-cvKOM случае, анализируя проростки такого возраста, можно достоверно отбирать сорта и селекционные формы с высокой устойчивостью (см. табл. 3).

5 Предварительные данные свидетельствовали о гсм, что наиболее надежные ре- зультати на уровне способа оценки степени морозоустойчивости озимой пшеницы можно получи it-, анализируя завершившие вто0 рую фазу закаливания 7-суточные проростки, Для проверки преднг.рмгельно полученных данных опыт с 7-суточными пророст амп был проведен повторно с включенном в него дополнительно трехсор5 той {тс j.i. l).

Различия в активности фермента между сортами, проростки которых подвергали нерпой ф- .че закаливания, имеются, однако они не настолько велики, чтобы считать их

0 мотодпгп г,оПными. Скорее, с этом случае их следует отнести к категории более или менее лзмстио выраженной тенденции.

lr n 3ofi e н дежные результаты, хэрак- тершут...ци сущоствопаниние взаимосвязи морозоустойчивости с активностью фер5 мента, опосредованные через ростовые процессы, получены в итоге анализа 7-су- точных проростков после завершения второй фазы закаливания. Необходимо подчеркнуть, что разрешающая способ0 ность технологии подготовки таких проростков к определению у них активности фермента позволяет надежно дифференцировать сорт и селекционный материал озимой пшеницы по признаку

5 морозоустойчивости. При этом в каждом опыте дол, ны фигурировать 1-2 сорта с заведомо изустным уровнем устойчивости (контроле). Сравнение исследуемых сортов и форм с контролем, выращенными и закаленными в строго аналогичных условиях, позволит проводить селекционную оценку озимой пшеницы на устойчивость к низким отрицательным температурам.

Формула изобретения Способ определения уровня морозоустойчивости озимой пшеницы, включающий стандартное двухфазное закаливание материала, определение ферментативной

активности и оценку уровня морозоустойчивости по изменению активности по сравнению с контролем, отличающийся тем, что, с целью упрощения, повышения достоверности определения и ускорения селекционного процесса путем сохранения изученных форм для дальнейшей работы, в качестве материала используют 7-суточные проростки, а оценку проводят по изменению активности ИУК-оксидазы.

Использование: сельское хозяйство, селекция озимой пшеницы. Сущность изобретения: способ основан на существовании связи между интенсивностью ростовых процессов и уровнем морозоустойчивости у озимой пшеницы. Семена исследуемых сортов проращивают при 20°С и 16-часовом освещении в течение 5, 7 и 10 и 15 сут. и далее подвергают их двуфазному закаливанию по стандартной методике. О степени морозоустойчивости сортов судят по активности ИУК-оксидазы - ключевого фермента, принимающего участие в осуществлении регуляции роста растений. Наиболее надежные результаты на уровне способа оценки уровня морозоустойчивости сортос и селек- . ционных форм можно получить, подвергая анализу завершившие вторую фазу, закаливания 7-суточные проростки. Самая высокая активность ИУК-оксидазы обнаружена у сортов с высокой устойчивостью, наиболее низкая - у слабоморозоустойчивых сортов. Отобранные формы могут быть включены в селекционную проработку с целью создания сортов с высокой морозоустойчивостью. 4 табл. (/ С

Таблица 1

Степень разрушения ИУК ферментной вытяжкой с ИУК-оксидазной активностью е надземной части растений озимой пшеницы, обладающей неодинаковой морозоустойчивостью, после выращивания при 20°С и 16-часовой длине дня (мкг ИУК/мин 1г сырой массы)

Таблица 2

Степень разрушения ИУК ферментной вытяжкой с ИУК-оксидазной активностью в надземной части растений озимой пшеницы, обладающей неодинаковой морозоустойчивостью, после прохождения первой фазы закаливания при 2°С и круглосуточном освещении (кг ИУК/мин 1г сырой массы)

Таблица 3

Степень разрушения ИУК ферментной вытяжкой с ИУК-оксидазной активностью в надземной части растений озимой пшеницы, обладающей неодинаковой морозоустойчивостью, после прохождения второй фазы закаливания при -3°С в темноте (мкг ИУК/мин 1 г сырой массы)

Таблица 4

Степень разрушения ИУК ферментной вытяжкой с ИУК-оксидаэной активностью в надземной части 7-суточных растений пшеницы, обладающей неодинаковой морозоустойчивостью, при 20°С и 16-часовой длине дня, а также после закаливания (мкг ИУК/мин 1 г сырой массы).

Продолжение табл.3