Способ определения человеческого гемоглобина в фекалиях Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, точнее к биохимическим методам обнаружения скрытой крови при диагностике различных клинически трудно диагностируемых кишечных заболеваний, таких как новообразования толстой и пря- . мой кишки,аденомы,язвы и дивертикулы.

Цель изобретения - повьшение специфичности и чувствительности определения.

Способ основывается на двухфазном анализе скрытой крови, соединяющий высокочувствительный анализ с использованием гваяковой смолы с высокоспе- цифическнм и чувствительным иммуно- химическим анализом, с помощью которого определяется только человеческий гемоглобин. Эта комбинация аналнзов устра1 яет ложные положительные результаты анализа,.а также необходимость в контроле за пищевым режимом.

Необходимое для предлагаемого способа оборудование включает пакет для анализа кала, в который помещают пробу, и второй пакет, имеющий бумаж- ньй фильтр. Абсорбент (бумажный фильтр) прикрепляется к оболочке пакета так, что находится между пропитанной гваяковой смолой, бумагой пакета и пластмассовой крьшкой.

Когда гемоглобин экстрагируют из абсорбента, получают раствор, со- держащий гемоглобин (Нв) и другие растворимые молекулы из кала, этот раствор переносят пипеткой в кювету из набора полистироловых кюветок на

СР

О5 СГ5 00

о

3149

creHKVi и на дно которой нанесено определенное количество антитела человеческого гемоглобина. Здесь гемоглобин пробы (антиген) связывает- ся с антигемоглобином твердой фазы (IgG), После инкубационного периода, равного, времени протекания иммунологической реакции, кюветку промывают водой для удаления всех несвя- занных веществ.

Твердая фаза может представлять собой полимер, отличный от полистирола, и иметь иную форму, отличную от кюветы или сосуда,например шари- |ка, кольца, диска.

I После того как кюветка промыта, в нее помещают определенное количество IgG антитела человеческого гемоглобина, при этом IgG имеет какой- либо фермент в качестве индикатора. Связывание помеченного ферментом IgG с антителом в твердой фазе зависит от количества свободных антител в твердой фазе, оставшихся пос- ле обработки пробы. Так, с помощью фермента можно проверить, была ли реакция между антителом (анти-НЬ человека) с антигеном (человеческим НЬ) путем добавления субстрата, спе- цифичного для данного фермента, при этом фермент вьщеляет из субстрата окрашенное видимое или фотометрически регистрируемое соединение. Количество фермента можно определить ли- бо измеряя количество, соединившееся с твердой фазой, либо количество, оставшееся в растворе свободным.

. Анализ FECA-EIA позволяет обнаружить только интактный гемоглобин че- ловека, а анализ на основе гваяковой смолы также обнаруживает продукты распада гемоглобина. Кроме того, устраняются ошибки, вызванные присутствием гемоглобинов животных, при- сущие известнь1м способам.

Пример. С лабораторной стороны крышки корпуса пакета берут абсорбент, содержащий пробу, и помещают в кюветку анализатора FP-9. Полистиро- ловая кюветка FP-9 предварительно сенсибилизирована с помощью иммуно глобулиновой фракции антигемоглобина 200 мкл буферного раствора, содержащего фосфат (0,1 М полибутадиенстиро ла, ,4), добавляют в кюветку. Инкубация, например, 2 ч при С. Кюветку промывают 400 мкл дистиллированной воды В кюветку добавляют

200 мкл иммуноглобулиновой фракции антигемоглобина человека (полибута- диенстирол в качестве растворителя) с подходящим ферментом, например щелочной фосфатазой (добавка конъю- гата). Инкубация, например, в течение 2 ч при . Промывка аналогична. Добавляется субстрат, специфичный для фермента, который используется в конъюгате (паранитрофенилфос- фат). После 30 мин инкубации при +37 добавляется 200 мкл 0,1 М NaOH для остановки реакции. Результат оценивается фотометрически.

Рекомендуемым пределом прекращения реакции является среднее значение абсорбции (минус контрольное значение), нормальных некровоточащих проб +3 стандартных отклонений или при отсутствии таких данных - 9200 единиц.

Наименьшие количества, обнаруженные посредством этого анализа, составляют 0,05-0,1 мкг цианметгемогло- бина (мл 1-5 мкл гемолизированной крови на 1 г фекалий), 140-700 мкг гемоглобина (г фекалий) и от 2,0 до 5,0 мкл цельной крови (г фекалий , (280-700 мкг .гемоглобина (г фекалий)

Формула изобретения

Способ определения человеческого гемоглобина в фекалиях путем иммуно- химического анализа, отличающийся тем, что, с целью повьше- ния специфичности и чувствительности способа,1 г образца адсорбируют через бумагу, пропитанную гваяковой смолой на фильтровальную бумагу, фильтровальную бумагу помещают в измерительную ячейку кюветы, предварительно обработанную в течение 15 ч при иммуноглобулиновой фракцией человеческого антигемоглобина, добавляют 200 мкл раствора фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,1 М поли- бутадиенстирола,инкубируют 2 ч при 37°С, промывают ячейку 400 мкл дистиллированной воды, вносят 200 мкл . раствора иммуноглобулиновой фракции человеческого антигемоглобина, соединенного с щелЬчной фосфатазой и растворенного в растворе фосфатного буфера, инкубируют 2 ч при 37 С, повторно промывают, добавляют 200 мк паранитрофенилфосфата и после инку 14966436

бирования в течение 30 мин при при 405 им определяют общий уровень реакцию прекращают с помощью 200 мкл содержания человеческого гемогло- , М раствора NaOH и по поглощению бина в образце.

Изобретение относится к медицине, точнее, к биохимическим методам обнаружения скрытой крови в фекалиях. Целью способа является повышение специфичности и чувствительности способа.Гемоглобин человека выделяют из пробы с помощью иммунохимической реакции, т.е. реакции между антителом и антигеном, при использовании закрепленного в твердой фазе специфического антитела гемоглабина человека. Затем определяют с помощью ферментативной реакции наличие гемоглобина, соединившегося с антителом