СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КРОВОПОТЕРИ ИЗ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА Российский патент 2000 года по МПК G01N33/72 G01N33/569 

Изобретение относится к медицине, точнее к иммунологическим методам обнаружения скрытой крови, и может быть использовано для диагностики кровотечений из желудочно-кишечного тракта и для контроля за динамикой процесса.

Известен способ определения кровопотерь из желудочно-кишечного тракта путем исследования кала, заключающийся в том, что фотоэлектроколориметрически определяют содержание гемоглобина в суспензии суточного кала и уровень гемоглобина в крови больного и по отношению концентрации гемоглобина в кале к концентрации в крови устанавливают объем кровопотери (Патент N 1127928 кл G 01 N 33/48, 1981).

Недостатками данного способа являются трудоемкость и необходимость соблюдения диеты в течение трех дней перед исследованием.

Наиболее близким аналогом к предлагаемому изобретению является способ определения человеческого гемоглобина в фекалиях, включающий в себя иммунохимическую реакцию, т. е. реакцию между антителом и антигеном, при использовании адсорбции специфических антител к гемоглобину человека на твердой фазе и последующего определения наличия гемоглобина с помощью ферментативной реакции.

Способ основывается на двухфазном анализе скрытой крови, соединяющем высокочувствительный анализ с использованием гваяковой смолы с иммунохимическим анализом (Патент N 1496643, кл. G 01 N 33/48, 1989).

Недостатком данного способа является трудоемкость и невозможность дифференциации гемоглобина и эритроцитов, что снижает диагностическую ценность теста.

Технический результат заключается в создании экспрессного способа определения скрытой крови и повышении его точности с возможностью количественного определения компонентов крови, а именно - гемоглобина и эритроцитов.

Задача решается за счет применения тест-набора для определения скрытой крови иммуносорбционным методом на основе реакции коагглютинации (РКОА), включающего следующие компоненты:
1) специфический антигемоглобиновый реагент (реагент A),
2) специфический антиэритроцитарный реагент (реагент В),
3) положительный контроль (гемоглобин),
4) отрицательный контроль (0,9% раствор NaCI),
5) магнитный стафилококковый реагент (реагент C).

Сущность изобретения заключается в постановке реакции коагглютинации (РКОА) с использованием высокоспецифических и чувствительных специфически направленных стафилококковых реагентов (СНСР) для определения гемоглобина или эритроцитов человека. Комбинация РКОА и предварительной истощающей сорбции кала на магнитном сорбенте "Магнобас", нагруженном белком A золотистого стафилококка штамма Cowan I, позволит устранить ложноположительные результаты анализа, а также необходимость в контроле за пищевым режимом.

Способ осуществляется следующим образом.

Пробу фекалий (1 см³) суспендируют в 1 мл 0,9% раствора NaCl. К 1 мл суспензии кала добавляют 1 мл реагента С, перемешивают и осаждают в постоянном магнитном поле. Таким образом достигается не только истощение иммуноглобулинов в исследуемой пробе, но и оседание крупных частиц кала, что облегчает учет результатов РКОА. Далее готовят двукратные разведения истощенной суспензии кала, которые исследуют в РКОА со специфическим реагентом A и (или) реагентом В. Параллельно готовят отрицательный и положительный контроли. Реакцию учитывают визуально при наличии выраженной РКОА в положительном контроле и отсутствии РКОА в отрицательном контроле. Учет реакции проводят по четырехкрестной системе, а затем делают расчет по формуле:
Y_Hb=X•4•6 мкг/см³,
где Y_Hb - искомое количество гемоглобина,
X - знаменатель последнего двукратного разведения пробы, которое учитывалось на три креста,
4 - коэффициент пересчета до исходного разведения кала,
6 мкг/см³ - показатель чувствительности специфического противогемоглобинового реагента (полученный опытным путем).

Для определения количества эритроцитов расчет проводят по формуле:
Y_Er=X•4•2,75•10⁵ клеток/см³,
где Y_Er - искомое количество эритроцитов,
X - знаменатель последнего двукратного разведения пробы, которое учитывалось на три креста,
4 - коэффициент пересчета до исходного разведения кала,
2,75•10⁵ клеток/см³ - показатель чувствительности специфического противоэритроцитарного реагента (полученный опытным путем).

Анализ с помощью тест-набора для определения скрытой крови иммуносорбционным методом на основе РКОА позволяет обнаружить гемоглобин человека, а также эритроциты человека или их фрагменты и дать количественную оценку, что повышает точность способа и особенно важно как для диагностики патологического процесса, так и для наблюдения за его динамикой. Проведение анализа не требует специального оборудования, соблюдения диеты и занимает 10-15 минут.

Пример 1.

Больной С. 30 лет, находился на лечении в гастроэнтерологическом отделении ГКБ N 2 с диагнозом: Неспецифический язвенный колит, легкое течение. Хронический гастродуоденит, обострение. В анамнезе - стул со слизью и кровью. На момент исследования визуально кровь в кале не определялась, амидопириновая проба была отрицательной. 1 см³ кала больного помещают в емкость и добавляют 1 мл 0,9% раствора NaCI, суспендируют. Затем 1 мл суспензии кала вносят во флакон с 1 мл реагента C, тщательно перемешивают и помещают флакон в постоянное магнитное поле. Частицы кала и реагент C оседают на дно флакона в течение 2-10 секунд. Надосадочную жидкость берут для приготовления двукратных разведений в полистироловом планшете. Из каждой ячейки полистиролового планшета берут 10 мкл соответствующего двукратного разведения и помещают на предметное стекло, затем к каждой капле добавляют по 10 мкл реагента A, осторожно перемешивают встряхиванием стекла и проводят учет РКОА по четырехкрестной системе. Последним двукратным разведением суспензии кала, которое учли как три креста, было 1/4. По формуле: Y=4•4•6=96 мкг/см³. Таким образом, в результате анализа кала предлагаемым способом была обнаружена скрытая кровопотеря в количестве 96 мкг/см³ гемоглобина, что позволило скорректировать лечение с учетом кровопотери, в то время как амидопириновая проба скрытого кровотечения не выявила.

Пример 2. Больная К. 60 лет, находилась на лечении в этом же отделении с диагнозом: Язвенная болезнь ДПК, обострение. Хронический эрозивный гастрит. Хронический гепатит. Амидопириновая проба была положительной. Анализ проводили аналогично примеру 1, ставили РКОА с реагентами A и B. Последним двукратным разведением суспензии кала, которое учли как три креста в реакции с реагентом A, было 1/4. Последним двукратным разведением суспензии кала, которое учли как три креста в реакции с реагентом В, было 1/4. По формуле Y_Hb= 4•4•6= 96 мкг/см³ Y_Er=4•4•2,75=22,0•10⁵ кл/мл. Таким образом, в результате анализа кала при помощи тест-набора для определения скрытой крови иммуносорбционным методом на основе РКОА была обнаружена скрытая кровопотеря в количестве 96 мкг/см³ гемоглобина и 22,0•10⁵ кл/мл эритроцитов.

Различие между обнаружением только гемоглобина или/и гемоглобина и эритроцитов позволяет предположить источник кровотечения и судить о тяжести заболевания, а также корректировать проведение диагностических процедур и лечения.

Пример 3.

Больной М. - воспитанник дома ребенка, возраст 1 месяц. Страдал выраженной молочницей, целиакией, мальабсорбцией. В анамнезе - постоянное нарушение стула. Диагноз оставался неясным. При первом исследовании кала на скрытую кровь бензидиновая проба была положительной, а анализ предлагаемым способом, проведенный аналогично примерам 1 и 2, выявил 192 мкг/см³ гемоглобина, а также 136•10⁵ эритроцитов в см³. Через неделю на фоне терапии бензидиновая проба оказалась отрицательной, в то время как предлагаемым способом было обнаружено 384 мкг/см³ гемоглобина. Еще через неделю и бензидиновая проба и предлагаемый способ стали отрицательными, что позволило судить о прекращении скрытой кровопотери. Одновременно у ребенка нормализовался стул и исчезли все проявления молочницы. Таким образом, использование тест-набора для определения скрытой крови иммуносорбционным методом на основе РКОА дало возможность проследить динамику кровопотери и провести адекватную терапию.

Предложенный способ определения кровопотерь из желудочно-кишечного тракта позволяет быстро (в течение 10-15 минут) обнаружить кровотечение, установить его тяжесть, а также провести комплекс лечебных мероприятий для устранения причины кровопотери, контролировать эффективность и продолжительность терапии, своевременно решать вопрос о хирургическом лечении.

Изобретение относится к медицине, точнее к иммунологическим методам обнаружения скрытой крови, и может быть использовано для диагностики кровотечений из желудочно-кишечного тракта и для контроля за динамикой процесса. Осуществляют постановку реакции коагглютинации (РКОА) с использованием специфически направленных стафилококковых реагентов (СНСР) для определения гемоглобина или эритроцитов человека. В суспензию кала предварительно добавляют магнитный стафилоккоковый реагент и осаждают ее в магнитном поле. Затем готовят двукратные разведения, с которыми проводят РКОА со специфическими антигемоглобиновым и антиэритроцитарным реагентами. Учет РКОА осуществляют по четырехкрестной системе. Рассчитывают кровопотери по формулам:
Y_Hb = Х • 4•6 мкг/см³,
где Y_Hb - искомое количество гемоглобина; Х - знаменатель последнего двукратного разведения пробы, которое учитывалось на три креста; 4 - коэффициент пересчета до исходного разведения кала; 6 мкг/см³ - показатель чувствительности специфического противогемоглобинового реагента,
Y_Er = X • 4 • 2,75 • 10⁵ клеток/см³, где Y_Er искомое количество эритроцитов; Х - знаменатель последнего двукратного разведения пробы, которое учитывалось на три креста; 4 - коэффициент пересчета до исходного разведения кала, 2,75 • 10⁵ клеток/см³ - показатель чувствительности специфического противоэритроцитарного реагента. Различие между обнаружением только гемоглобина или и гемоглобина и эритроцитов позволяет предположить источник кровотечения. Способ позволяет повысить точность с возможностью количественного определения гемоглобина и эритроцитов экспрессным методом.

Способ определения кровопотери из желудочно-кишечного тракта путем определения концентрации компонентов крови в кале, отличающийся тем, что в суспензию кала предварительно добавляют магнитный стафилококковый реагент и осаждают ее в магнитном поле, затем из нее готовят двукратные разведения, с которыми проводят реакцию коагглютинации (РКОА) со специфическими антигемоглобиновым и антиэритроцитарным реагентами, учет РКОА осуществляют по четырехкрестной системе, а расчет кровопотери - по формулам
Y_Hb = X • 4 • 6 мкг/см³,
где Y_Hb - искомое количество гемоглобина;
X - знаменатель последнего двукратного разведения пробы, которое учитывалось на три креста;
4 - коэффициент пересчета до исходного разведения кала;
6 мкг/см³ - показатель чувствительности специфического противогемоглобинового реагента,
Y_Er = X • 4 • 2,75 • 10⁵ клеток/см³,
где Y_Er - искомое количество эритроцитов;
X - знаменатель последнего двукратного разведения пробы, которое учитывалось на три креста;
4 - коэффициент пересчета до исходного разведения кала;
2,75 • 10⁵ клеток/см³ - показатель чувствительности специфического противоэритроцитарного реагента.