Способ диагностики гипертонической болезни Советский патент 1989 года по МПК G01N33/68 A61B10/00 

3IA

рфсуспендируют в 10 мл среды выделе- и центрифугируют в том же режи- Затем супернатанты объединяют и центрифугируют 1 ч при 45000go Полученную микросомальную фракцию ре- суспендируют в 2,5 мл среды выделения и обрабатывают ДЦС-Na по методу Й()ргенсёнао Микросомальный материал разводят в среде : 3 мМ АТФ, 2 мМ ЭЖТА, 20 мМ Трис (рН 7,4 при 25°С); по капЛ ям добавляют ДДС-Na при постоянном перемешивании, при этом ко- н(чная концентрация белка должна составлять 1,4 мг/мл, а содержание ZClC-Na 0,1 - 0,5 мг/мл После стояния полученного раствора 30 мин на магнитной мешалке при 25 С, его порциями, по 3,5 МП, наслаивают на градиент плотности сахарозы, составлен- ний в центрифужных пробирках на 13,5 мл 29%-ной, 8,0 мл 1 %-ной и 5,0 мл 10%-ной сахарозыо Все растворы сахарозы готовят на бу- ффре: 20 мМ Трис и 1 мМ ЭДТА (рН 7,4 пфи 4 С)о После центрифугирования (ilO мин, 105000g при ) осадки объединяют и суспендируют в 1,5 мл вьщеленияо Полученный препарат ГГа, К-АТФазы разливают по 100 мк в пластмассовые пробирки и хранят при не более 2 месо Концентрация белка в препарате9 определяемая м тодом Лоури, составляет 1-3 мг/мл, а активность Na, К-АТФазы 1000 - 1-iOO мкмоль белка в 1 ч, Фер- мфнтный препарат не содержит Mg-АТФа3..

Определение степени ингибирова- НИН Na, К-АТФазы сывороткой крсши. А1|:тивность фермента измеряют с 2$0 мкл сыворотки и без нее (250 мкл Hi о) в 1 мл (гчеды инкубации, N|CI 90; KCl 60; MoCl 3; АТФ. 3; ийидазол 30: (рН 7,4 при 37 С)о Реак- ц гидролиза АТФ начинают добавлением ферментного препарата (10 - 20 мкг) и после 5-10 мин инкубации останавливают добавлением трихлоук- сусной кислоты до конс:чной концент- рации 10 %о После осаждения белка (1200 g, 5 мин) в супернатанте измеряют содержайие Ф. методом Фиеке Суббароуо Степень ингибирования ак- тйвности Na, К-АТФазы рассчитывают в % как разницу между величинами активности фермента с (100%) и без сыворотки в среде инкубации.

0

0

5 5 0

д j

5

Определение содержания в сыворотке крови белков с мол,массой 12 и 5 кД.

Методом электрофоретического анализа сыворотки крови определяют содержание в ней низкомолекуля1)ных белков (%), используя соответствующие величины площадей пиков, полученных при сканировании электрофореграммы на Ultrascan lazer densitometer- 2220 (1 кВ) при 550 нм„

Предварительно сыворотку крови разводят,в 20 раз раствором: 0,025 Трис-НС1 (рН 6,8), 5% глицерин, 2% ДЦС-1Та, 2,5% /3-меркаптоэтанол и нагревают при 80°С 3 мин. Электрофорез в полиакриламидном геле проводят в присутствии ДЦС-Na, используя прибор для вертикального электрофореза (Bio - Had, 220), Процесс длится 4 ч при постоянном токе 40 мА на пластину. Окрашивание белковых полос осу1цествляют 30 мин при в среде, % кумасси R-250 0,25; изопропа- нол 20; уксусная кислота 7„ От избытка красителя гель отмывают в смеси 20% изопропанола и 7% уксусной кислоты

Статистическую обработку данных осзддествляли, используя программы 7Д, 6Д и 7М из пакета программ ВМДП-77 -для анализа биологических и медицинских данныхо Наибольшую вероятность правильной классификации удалось получить только при использовании в пошаговом дискриминационном анализе комбинации всех трех измеряемых параметров сьшоротки крови, на основе чего выведено каноническое уравнение (1), Подставляя в него значения степени ингибирования Na, К-АТФазы сывороткой крови и содержания в ней белков с моломассой 12 и 15 кД определяют индекс риска данного пациента, при значениях которого -0,2 выявляют гипертоническую .болезнь,

Способ опробован на группе пациентов (20 человек) в возрасте от 16 до 46 лет, 10 из которых имели нормальное артериальное давление, а 10 - страдали гипертонической бо- яезнью I-II стадий. Все пациенты в течение 2 недель до начала обследования не принимали гипо Уензивных лекарств , Пациенты контрольной группы имели систолическое артериальное давление 140 мм рТоСТо и/или диастолическое 90 мм рТоСТ Диагноз гипертонической болезни ставился при систолическом давлении 160 мЬрт.ст. и/или диастолическом 95 мм рТоСТ,, при отсутствии клинических дангсых, подтверждающих симптоматический характер повьшения артериального давления .

Пример 1 о Определение индек- ю са риска для пациента с гипертонической болезнью

Определяли степень ин ибиpoвaния Na, К-АТФазы сывороткой крови.Реакцию ферментативного гидролиза АТФ 15 проводили в двух центрифужных пробирках, содержащих по 1 мл среды инкубации. В одной находилось 250 мкл сыворотки, а в другой 250 мкл . Реакцию начинали добавлением 15 мкг 20 ферментного препарата, предварительно полученного из солевых желез уток После 5 мин инкубации при реакцию останавливали добавлением трихпоруксусной кислоты (конеч- 25 мая концентрация 10%), сывороточный белок удалили центрифугированием (1200 g, 5 мин)о В супернатанте выделили содержание Ф„ методом Фис- ке-Суббароу, измеряя оптическую плот- 30 ность относительно контрольной пробы на фотоэлектрокаллориметре (Zal при 650-660 нм в 5 мм кюветах В контрольные пробы, содержащие либо . 250 мкл сьшоротки, либо 250 мкл , 35 препарат Na, К-АТФазы после трихлор- уксусной кислоты не добавляли.

Активность Na, Л-АТФазы без сыворотки составляла 1200 мкмоль Ф„/мг белка в 1 ч, а с ней - 240 мкмоль

Фц/мг белка в 1 ч, что соответствует 80%-ному ингибированию фермента.

Для определения содержания в сыворотке крови белков с мол«массой 12 и 15 кД проводили электрофорез f образцов сыворотки крови в полиакрил- амидном геле в присутствии ДДС-Nao Процентное содержание в сьгаоротке крови белка 12 кД составило 4,0%, а 15 кД белка 2,2% Полученные величи- ны подставляют в уравнение (1):

Y 0,096-80 + 0,,0 + + 0,39-2,2-8,31 2,6.

Таким образом, Y -0,2,

П р и м е р 2о Определение индекса риска для пациента с нормальным уровнем артериального давления.

5 0 5 0 5

5

Степень ингибирозания Na, К-АТФазы сывороткой крови и-содержание в ней 12 и 15 кД белковых компонентов определяли по примеру 1

Активность Na, К-АТФазы без сыво-. ротки крови составляла 1200 мкмоль Ьц/мг белка в 1 ч, а с ней - 672 мкмоль белка в 1 ч, что составляет 59% от первой величины и соответствует 41%-ному ингибированию Na, К-АТФазыо Содержание в сыворотке крови белков с мол.массой 12 и 15 кД составляло 2,0 и 1,5% соответственно. Подставляя полученные величины в уравнение (1):

Y 0,096-41 -ь 0,6-2,0 +

+ 0,39-1,5-8,39 -2,6, получают Y -0,2.

П р и м е р 3. Определение индекса риска при его пограничном значении для пациента с гипертонической болезнью

Степень ингибирования Na, К-АТФазы сывороткой крови и содержание в ней 12 и 15 кД белковых компонентов определяют по примеру 1.

Активность Na, К-АТФазы без сьгоо- ротки составляла 1200 мкмоль Фц/мг белка в 1 ч, а с ней - 685 мкмоль белка в 1 ч, что соответству-- ет 43%-ному ингибированию фермента. Содержание в сыворотке крови белков с моЛоМассой 12 и 15 кЛ составляло 3,2 и 5,2 % соответственно. Полученные величины подставляют в ураыге- ние (1):

Y Oj096 43 + 0,6 -3,2 + - 0,39-5,2 - 8,31 -0,2„

Приведенные примеры показьшают, что предлагаемый способ диагностики гипертонической болезни позволяет выявить ранние стадии развитии болезни, не прибегая к длительным клиническим исследованиям. Биохимическое тестирование сьторотки крови может быть применено при массовых профилактических обследованиях пациентов,

В среднем для группы больных характерны как более высокий уровень ингибирования сывороткой крови Na, К-АТФазы, так и более высокое содержание в сьторотке белков с - сой 12 и 15 кД, а также их суммы (табл..1)о При высоком уровне достоверности различий измеряемых параметрой между группами (табЛо2) наблю- дан)тся значительные отклонения от среднего, поэтому значения измеряе- мь« параметров для контрольной и опытной групп существенно перекрьгоа- ютсяо Таким образом, каждый из этих паг аметррв по отдельно сти не может бы+ь использован для диагностики гиnei

тензивного состояния, В то же

10

корреляционный анализ показал,

I эти параметры не связаны между

ч тс

соМой (табл.2). Методом пошагового

дискриминационного анализа показан

что наилучших результатов, Тс,е

ЮС

клг

только при использовании всех трех

%-ную вероятность правильной ссификации, удается получить

nai

аметров сьгаоротки кровис

20

Ф

рмула изобретения

ко

I Способ диагностики гипертоничес- i болезни, включающий определение

действия сыворотки крови пациентов на активность препарата Na, К-АТФазы с последующей оценкой степени инги- бирования фермента, отличающийся тем, что, с целью увеличения точности способа, дополнительно проводят элетрофорез сьгооротки крови определяют процентное.содержание в ней белков с мол„массой 12 и 15 кД, затем рассчитьшают индекс риска Y по формуле

Y 0,096 А + 0,6 В + 0,39 С 8,31, (1)

где А - степень ингибирования Na,

К-АТФазы, %; В - содержание белков с моломассой 12 кД,%; С - содержание белков с моломассой 15 кД, %,

и при значених индекса риска более или равном -0,2 диагностируют гипертоническую болезнь.

Т а б л и ц а 1

Изобретение относится к медицинской области, а именно к способам биохимического тестирования сыворотки крови для ранней диагностики гипертонической болезни. Целью изобретения является увеличение точности способа выявления больных гипертонической болезнью на ранних стадиях ее развития. Эта цель достигается тем, что, кроме исследования действия сыворотки крови пациента на активность NA, K - АТФазы, с последующей оценкой степени ингибирования, % (A), дополнительно проводят электрофорез сыворотки крови, определяют процентное содержание в ней белков с мол.мас. 12 кД (B) и 15 кД (C). Затем расчитывают индекс риска /У/ по формуле У=0,096A ± 0,6B + 0,39C - 8,31 при значениях индекса риска ≥-0,2 выявляют гипертоническую болезнь. При использовании предложенного способа вероятность правильной классификации пациентов на людей с гипертонической болезнью и с нормальным артериальным давлением составляет 100% и на 40% увеличивается точность диагностирования по сравнению с известными способами за счет использования в независимых друг от друга параметров, сопутствующих гипертонической болезни.