Способ исследования окислительного цикла "глюкоза/жирные кислоты" в тканях организма Советский патент 1989 года по МПК G01N33/66 

Изобретение относится к экспериментальной медицине.

Целью изобретения является повышение точности способа при исследовании in vitro.

Согласно предлагаемому способу в качестве модулятора окисления глюкозы и жирных кислот используют .2-ме- тш1-3-пиперидинометил-1,4 нафтохи- нон (А).

По реципрокному характеру сдвига окисления глюкозы и ..жирных кислот судят о наличии окислительного цикла глюкоза/жирные кислоты в тканях организма животных.

Способ поясняется примерами.

Пример 1. Выявление метабо- лического цикла глюкоза/жирные кислоты в изолированных тромбоцитах человека.

Тромбоциты изолируют из венозной крови человека с помощью дифференциального центрифугирования и суспендируют в буферном растворе Кребс-Рин- гера (рН 7,4) с добавлением глюкозы 1 г/л, при этом в 1,0 мл суспензии содержится 0,95 мг белка. 1,5 мл суспензии тромбоцитов вливают в конические сосуды, в центре которых расположен цилиндр, в который вкладывают кисточки из фильтровальной бумаги для связывания вьщеляемого (кисточку предварительно смачивают раствором гайамина). Число контрольных и опытных образцов - по 5 штук в каждой серии. К контрольным образцам

СП

ел

со

00

добавляют физиологический раствор, к опытным - раствор соединения А до концентрации 1 мкмоль/л. Затем в каждый сосуд добавляют по 10 мкл меченого субстрата; содержащего 37 кБк (1 мкКи) радиоактивной метки: 1- С глюкозы или 1-е пальмитоил-СоА. Сосуды плотно закрывают и инкубируют при 37°С в течение 60 мин. Затем в каждый сосуд вливают по 0,2 мл концентрированной перхлорной кислоты для высвобождения из инкубационной смеси

598

14

15

СО, флаконы вновь плотно закрывают и инкубируют в течение 30 мин, извлекают фильтровальную бумагу, высушивают и помещают ее во флаконы со сцинтнпляционной жидкостью Ж-106 для измерения радиоактивности.

Результаты измерений (число импульсов за 1 мин) выражают в пикомо- лях (пмоль) субстрата, окисляемого в течение 1 ч в тромбоцитах (1 мг белка) и обрабатывают статистически. Данные приведены в табл. 1.

Таблица 1

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для выявления окислительного цикла "глюкоза/жирные кислоты" в тканях организма животных. Цель - повышение точности способа. Способ заключается в том, что в качестве модулятора окисления глюкозы и жирных кислот используют 2-метил-3-пиперидинометил-1,4 нафтохинон, а о наличии окислительного цикла глюкозы и жирных кислот в тканях организма животных судят по реципрокному характеру сдвига окисления глюкозы и жирных кислот. 2 табл.

Из табл. 1 видно, что под влияние воздействия соединения А in vitro наступает увеличение окисления глю- козы (195,5% контрольного показателя и снижение окисления пальмитиновой кислоты (66,2% контрольного показате ля), т.е. торможение окисления жирны кислот сопровождается увеличением

окисления глюкозы, что указывает на окислительный цикл глюкоза/жирные кислоты в тромбоцитах человека.

Пример 2. Выявление окисли- тельного цикла глюкоза/жирные кислоты в скелетной мьтще диабетических крыс после введения им соединения А.

Диабет вызывают у крыс линии Вис- тар путем однократного введения ап- локсана в дозе 15 мг/кг внутрибрю- шинно. На 7-й день после введения проводят определение концентрации глюкозы в крови и отбирают животных, у которых этот показатель превышает 200 мг/100 мл крови. Дальнейшие наблюдения проводят над тремя группами крыс. Контрольной группе диабетических крыс вводят физиологический раствор под кожу в течение 10 дней, опыт- ной группе диабетических крыс вместо физиологического раствора ежедневно вводят под кожу соединение А в дозе 0,3 мг/кг веса (при идеальном равно

0

о

5

0

мерном распределении такая доза должна бы создать м всромолярную концентрацию соединения А в организме животного) . Третья группа крыс - интакт- ные животные. На 10-й день крысам дают гексеналовый наркоз (40 мг/кг массы тела) внутрибрюшинно, вскрывают грудную клету, из сердца шприцем отсасывают по возможности всю кровь, затем берут навески из скелетной мышцы (мышцы бедра), с помощью стеклянного гомогенизатора готовят 10%-ный гомогенат в буфере Кребс-Рин- гера (рН 7,4), содержащем хлористый магний в концентрации 2 мМ/л и глюкозу (1 г/л). В качестве субстратов окисления используют 1- С пальмитиновую кислоту (в комплексе с альбумином) и глюкозу. Окисление субстратов проводят по методу, опи санному в примере 1, но в качестве показателя окисления пальмитиновой кислоты используют количественные сдвиги меченой кислоты в инкубационной смеси. Дпя этой цели после добавления перхлорной кислоты для остановки реакции окисления инкубационную смесь нейтрализуют раствором гидроокиси натрия, проводят экстракцию и разделение их в тонком слое силикагеля. Хроматограммы проявляют в парах йода, полосы, соответствующие фрак1ши жирных кислот, соскабливают в счетные флаконы для измерения радиоактивности, используя жидкий толуоловый сцинтиллятор же-106.

Как видно из табл. 2, введение соединения А крысам с аллоксановым диабетом сопровождается усилением окисления пальмитиновой кислоты и снижением окисления глюкозы мышечной тканью: количество пальмитиновой кислоты в инкубационной смеси уменьшается на 20,6% по сравнению с контролем, что свидетельствует об увеличении ее использования, однако окисление глюкозы под влиянием воздействия соединения А составляет лишь 68,9% контрольного показателя. Это указывает на осуществление окислительного цикла глюкоза/жирные кислоты В скелетной мышце диабетических кры

Результаты измерений вьфажают в пикомолях меченого соединения, окисляемого за 1 ч, В- пересчете на 1 г мышцы. Результаты приведены в табл. 2,

Таблица 2

Ф о р м ула изобретения

. Способ исследования окислительного цикла глюкоз а/жирные кислотны в тканях организма путем введения радиоактивно меченного субстрата с последующей регистрацией реципрокного сдвига окисления глюкозы и жирных кислот, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, при исследовании in vitro, предварительно перед введением субстрата вводят 2-метил-З-пиперидиноме- тил-1,4-нафтохинон в концентрации .