Штамм бактерий BacILLUS SUвтILIS-продуцент @ -глюканазы Советский патент 1989 года по МПК C12N9/42 C12N9/42 C12R1/125 

Изобретение относится к микробиологической промьгашенности, в частности, к получению нового штамма, используемого для получения фермента каназы, расщепляющего полисахариды с -1,3/1,4 глюкозидными связями, /i-глюканаза может быть использована в пищевой промьшшенностио

Цель изобретения - получение нового шта№1а продуцента /5-глюканазы с более высокой ферментативной активностью.

Штамм Bacillus subtilis (Т-86) БКПМ В-3936 вьщелен из почвы при поиске и отборе продуцентов / -глюканазы на плотной питательной среде со специфичным субстратом - лихенином. Основным критерием отбора являлись прозрачные зоны вокруг колонии, воз-.

никшие. при гидролизе окрашенного субстрата во время роста исследуемых микроорганизмов. Дальнейшее и сследо- вание ферментативной способности отобранных продуцентов при глубинном их культивировании показало, что наиболее высокой /i-глюканазной активностью обладает штамм В.subtilis Т-86, кото- рьй имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки.

Клетки культуры имеют форму палочки размером 0,5-0,75 « 2,5-3,0 мкм. Выращенные на богатой питательной среде клетки имеют вид толстых палочек, иногда расположенных в цепочках. Клетки культуры грам-положительные, без капсул, подвижные с помощью перитри- хальных жгутиков. Споры цилиндрические или эллипcoIiaныe, прорастание спор

сл о ч ч

QD 00

экваториальное путем разрыва мембран вдоль экватора.

Культурально-физиологические признаки.

На мясопептонном агаре после 24- часовой инкубации при колонии диаметром 2-7 мм. Колонии на МПА с гладкими краями, непрозрачные с выраженным центром. На ломтике карто- :феля рост обильный, пленка сухая, толстая, морщинистая, серовато-белого цвета.

Культура - строгий аэроб с оптима :Ной температурой роста 37°С при рН 6,2-6,6, При росте усваивает глюкозу лактозу, сахарозу, декстрозу и манни 1с образованием кислоты, углеводы - ксилозу, мальтозу, дульцит, адонит, гидролизует с образованием щелочи, Нитраты восстанавливает до нитритов. Гидролизует крахмал, разжижает желатину, пептонизирует молоко. На среде Кларка не образует ацетилметилкар- бинол.

Культура поддерживается на ломтиках картофеля и хранится в консервированном виде (на ломтиках картофеля в-пробирках, лишенных кислорода а также в лиофилизированном виде)

Пример 1„ Получение куль- туральной жидкости в колбах.

Для глубинного выращивания штамма Б,subtills используют питательную среду следующего состава, г/л;

Нерастворимьй крахмал 239,00 i Кукурузный экстракт 11,40 Дрожжи пивные2,20

J,, Лактоза0,60

Аммоний фосфорно

кислый 2-зам. Медь сернокислая Натрий хлористый Магний сернокислый К.алий сернокисльм Кальций хлористый

Среду готовят в несколько этапов. Осахаривание крахмала.

Для получения 1 л среды 239 г нерастворимого крахмала заливают 530 мл воды, перемешивают и добавляют 0,9 г бактериальной амилазы, подогревают на водяной бане до 85°С и вьщерживают при перемешивании 30 мин, далее температуру поддерживают 100°С в течение 1 ч, охлаждают. Качество осахари- вания проверяют с йодом, который не должен дать синего окрашивания.

Q

0 5

о

5

0

5

Приготовление раствора основных компонентов среды.

В 137 мл воды растворяют остальные компоненты среды кроме фосфата аммония, прибавляют осахаренный крахмал, перемешивают, рН доводят NaOH или HjPO до 7,0, проверяют объем, который должен быть 667 мл- (при необходимости прибавляют воду) и разливают по 34 мл в колбы емкостью 750 мл стерилизуют при в течение 30 мин.

Приготовление раствора фосфатов.

В 333 мл подогретой до воды растворяют 8,4 аммония фосфорнокислого 2-зам. Раствор разливают по 16,5мл в пробирки и стерилизуют при 125 С в течение 30 мин.

Перед засевом в стерильных условиях к каждой колбе прибавляют 16,5 мл раствора фосфатов и среду засевают односуточной культурой B.subtilis Т-86. Выращивание проводят при на качалке с 180 об/мин. На 72-м часу роста определяют /i-глюканазную активность (по определению-восстанавливающих Сахаров с применением реактива ДНСК) при рН 6,5 и 30°С,используя субстрат - лихенин, которая составляла 20 ед/мл.

Пример 2, Получение, куль- туральной жидкости в бродильных установках.

Культивирование штамма B.subtilis. Т-86 проводят в бродильных установках типа Биолафит с 10 л питательной среды, полученной по примеру 1, Ферментацию производят с подачей воздуха 6 л/мин и перемешиванием среды 240 об/мин. Для пеногашения используют синтетический пеногаситель про- пинол (0,1%). Ферментацию прерьшают после 48 ч культивирования, так как в данный момент .питательная среда уже истощается углеводами и в культураль- ной жидкости опрёделйют /j-глюканаз- ную активность.

Результате испытания нового штамма B.subtilis Т-86 - продуцента /з-глюка- назы и прототипа B.subtilis, 402 приведены в таблице. I

У прототипа за единицу активности принимается такое количество фермента, под действием которого за 20 мин гид- ролиза при температуре 30°С образуется 1 мг редуцирукщих веществ в пересчете на глюкозу, а у предлагаемого штамма - количество фермента, под

при 30,С образуется такое количество реду1Д1рующих веществ, которое соот- вествует 1 мкМ глюкозы (0,18 мг). Для сравнения единицы активности у прототипа быпи перечислены на единицы активности предлагаемого штамма.

Иэ таблицы видно, что при использовании штамма B.subtilis Т-86 р-глю- ю каназная активность культуральной жидкости В 2 раза вьш1е, чем B.subtilis 402.

Применение предлагаемого штамма для получения /з-глюканазы позволит J5 увеличить ферментативную активность на 100%.

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-3936 - продуцент уз-глюканазы.

Продуцент

Активность, ед7мп, при к льтивировании

в колбах J в биолафятах

20 2

9.7

41 6

Изобретение относится к микробиологической промышленности , в частности, к получению нового штамма, используемого для получения фермента β-глюканазы, расщепляющего полисахариды с β -1,3/1,4 глюкозидными связями, β-глюканаза может быть использована в пищевой промышленности. С целью повышения β-глюканазной активности в качестве продуцента используют штамм BACILLUS SUBTILIS ВКПМ В-3936, выделенный из почвы на плотную питательную среду, содержащую субстрат лихенин ОЛ-11. Применение предлагаемого штамма позволяет увеличить ферментативную активность на 100%. 1 табл.