ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS - ПРОДУЦЕНТ ОСАХАРИВАЮЩЕЙ АМИЛАЗЫ, РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ ПУЛЛУЛАН Российский патент 1995 года по МПК C12N9/26 C12N9/44 C12N9/26 C12R1/07 

Изобретение касается микробиологической отрасли промышленности, в частности производства ферментов, и представляет собой новый штамм Bacillus subtilis T-2 продуцент осахаривающей амилазы.

Полученный препарат на основе заявляемого штамма может быть использован в крахмалопаточной отрасли промышленности при гидролизе крахмала с целью получения кристаллической глюкозы, мальтозных паток, глюкозо-фруктозных сиропов, а также в пивоваренной и спиртовой отрасли с целью гидролиза крахмалсодержащего сырья.

Наиболее близким прототипом к заявленному штамму является способ получения ферментного препарата из Bacillus subtilis c α -амилазной активностью, расщепляющего как α-1,6-так и α -1,4-гликозидные связи.

Полученный фермент с рН оптимумом 5,0-7,5 и температурным оптимумом 60-63^оС способен гидролизовать крахмал с получением патоки, содержащей мальтозу и мальтотриозу в количестве (40-50)% каждый к массе крахмала.

Продуцент культивировали на среде следующего состава, соевая мука 5,0; кукурузный экстракт 0,5; мясной экстракт 0,4; K₂HPO₄ 0,3; MgSO₄˙7H₂O 0,1; крахмал растворимый 2,0; мочевина 0,5; CuSO₄ 5˙10^-5; MnCl₂ 1˙10^-4; CaCl₂ 1˙10^-4; Zn_SO₄ 1˙10^-4; FeSO₄ 1˙10^-5, при 30^оС, рН 7,0 в течение 3 дней.

В качестве посевного использовали клетки продуцента, культивируемые на агаризованной среде, следующего состава, полипептон 1,0,
растворимый крахмал 1,0,
K₂HPO₄ 0,3,
MgSO₄˙7H₂O 0,1.

Инокулят культивировали при 30^оС в течение 72 ч.

В полученной культуральной жидкости пуллуланазная активность 9,6 ед/мл, амилолитическая активность 45,2 ед/мл.

Существенный недостаток штамма прототипа:
низкая амилолитическая активность;
отсутствие в комплексе ферментов β-глюканазы.

Целью изобретения является получение нового штамма Bacillus subtilis T-2, обладающего повышенной способностью гидролизовать α-1,6 и α-1,4 гликозидные связи в крахмале.

Предлагаемый штамм выделен из торфяников Шатуры методом накопительной культуры, в качестве субстрата использовали 0,5% пуллулан.

Полученный штамм депонирован в ВКПМ под номером В-5166.

Культурально-морфологическая характеристика
Штамм представляет собой спорообразующую палочку, образующую цепочки из подвижных палочковидных клеток по 3 в парах или одиночных размером (0,5-0,7)х(0,8-1,2) мкм. Палочки подвижны, грамположительные. Споры овальные, при спорообразовании изменения формы спорангия не происходит.

Физиолого-биохимическая характеристика.

На МПА образует колонии, бежевого цвета с ровными краями, на картофельном агаре рост обильный, пленка сухая, морщинистая толстая кремового цвета, при росте на бульоне (МПБ) образует поверхностную пленку, которая впоследствии опускается на дно.

Культура строгий аэроб, с оптимальной температурой роста 34^оС-37^оС и рН 5,8-6,5.

Утилизирует глюкозу с образованием кислоты без выделения газа, а также цитрат, казеин, глицерин. Утилизирует крахмал, декстрины, гликоген, амилопектин, мальтозу, мальтотриозу, пуллулан, изомальтозу, глюкозу. Ксилозу и арабинозу не утилизирует.

Нитраты не восстанавливает.

Для определения активности ферментов культуральную жидкость центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 мин и использовали супернатант.

Пуллуланазу определяли по восстанавливающим сахарам, образующимся при гидролизе пуллулана (линейного полисахарида, состоящего из мальтозных единиц, соединенных α-1,6-гликозидными связями).

За единицу пуллуланазной активности принимается такое количество фермента, которое при стандартных условиях (температура 60^оС, рН 4,7) гидролизует пуллулан со скоростью, соответствующей образованию восстанавливающих групп, эквивалентных 1μ молю глюкозы в минуту, определяемых методом Сомоджи-Нельсона.

Осахаривающую амилазу определяли по способности образовывать восстанавливающие сахара, образующиеся при гидролизе крахмала.

За единицу амилолитической активности принимается такое количество фермента, которое при стандартных условиях (температуре 60^оС, рН 4,7) гидролизует крахмал со скоростью, соответствующей образованию восстанавливающих групп, эквивалентных 1μ молю глюкозы в минуту, определяемых методом Cомоджи-Нельсона.

Протеолитическую активность определяли по способности катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот. За единицу протеолитической активности (ПС) принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при рН 5,5 и температуре 30^оС превращает в неосаждаемые трихлоруксусной кислотой состояние казеината натрия, в количестве, соответствующем 1 мкмолю тирозина (1 мкмоль тирозина равен 0,181 мг), активность выражается в ед/г (ГОСТ 20264.2-88).

β -глюканазную активность определяли по способности образовывать редуцирующие сахара из лихенина или ячменного β-глюкана с последующим определением образовавшихся сахаров по методу Сомоджи-Нельсона. Биоорганическая химия, 1980, т.6, с.1225-1242.

За единицу β-глюканазной активности принимали количество фермента, способного образовывать в минуту (в стандартных условиях при температуре 30^оС и рН 5,5) из глюкана такое количество олигосахаридов, которое по восстанавливающей способности соответствует 1 мкмолю глюкозы.

Все опыты проводили в 3 повторностях.

П р и м е р 1. Продуцент Bacillus subtilis T-2 выращивали в аэробных условиях в колбах емкостью 0,75 дм³ при коэффициенте заполнения 0,4 в течение 72 ч при 30^оС и рН_нач. 7,0 на среде прототипа, имеющей состав, г/дм³: Соевая мука 50,0 Мясной экстракт 4,0 Кукурузный экстракт 5,0 K₂HPO₄ 3,0 MgSO₄˙7H₂O 1,0 Крахмал растворимый 2,0 Мочевина 5,0 CuSO₄ 5х10^-5 MnCl₂ 2,5х10^-6 CaCl₂ 1х10^-4 ZnSO₄ 1х10^-4 FeSO₄ 1х10^-5
В качестве посевного использовали клетки продуцента, культивируемые на агаризованной среде, следующего состава, Полипептон 1,0 Растворимый крахмал 1,0 K₂HPO₄ 0,3 MgSO₄˙7H₂O 0,1
Инокулят культивировали при 30^оС в течение 72 ч.

Пуллуланазная способность 0,9 ед/мл, амилолитическая способность 140 ед/мл, β-глюканазная способность 15 ед/мл, протеолитическая способность 10,0 ед/мл.

П р и м е р 2. Продуцент Bacillus subtilis T-2 выращивали в аэробных условиях в колбе емкостью 0,75 дм³ при коэффициенте заполнения 0,4 в течение 72 ч при 34^оС.

Посевной выращивали на агаризованной среде следующего состава, г/дм³: (NH₄)₂SO₄ 0,4 MgSO₄˙7H₂O 1,0 CaCl₂:2H₂O 0,5 KH₂PO₄ 6,0 Триптон 10,0 Крахмал растворимый 5,0 РН (4,5-5,0) Температура 34^оС в течение 72 ч.

Состав для культивирования, г/дм³: MgSO₄ 1,0 KH₂PO₄ 2,0 (NH₄)₂SO₄ 1,0 MnCl₂ 0,0025 CaCl₂ 0,4 Соевая мука 25,0 Крахмал растворимый 60,0 Кукурузный экстракт 20,0 Начальный рН среды (5,5-5,8).

Пуллуланазная способность 1,6 ед/мл, амилолитическая способность 246,0 ед/мл, β-глюканазная способность 22,0 ед/мл, протеолитическая способность 20,0 ед/мл.

П р и м е р 3. Гидролиз 30% крахмала проводили с использованием фильтрата культуральной жидкости, полученной по примеру 2, при рН 4,7, температуре 60^оС в течение 24 ч из расчета 0,1 ед пуллуланазы на 1 г крахмала.

Анализ продуктов гидролиза методом ТСХ показан в таблице.

Предлагаемый штамм Bacillus subtilis T-2 имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:
более высокую α-амилазную активность;
наличие в ферментативном комплексе термостабильной β-глюканазы с рН оптимумом в кислой зоне;
термостабильную нейтральную протеазу;
высокий выход глюкозы (64%) и суммарный выход глюкозы и мальтозы (82%).

Эти указанные преимущества дадут возможность использовать препарат на основе этого штамма в различных областях пищевой промышленности (крахмалопаточной, пивоваренной, спиртовой).

Использование: биотехнология, может быть использован в крахмалопаточной отрасли промышленности при гидролизе крахмала с целью получения кристаллической глюкозы, мальтозных паток, глюкозо-фруктовых сиропов, а также в пивоваренной и спиртовой отраслях с целью гидролиза крахмалсодержащего сырья. Сущность изобретения: штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-5166 обладает повышенной способностью гидролизовать α-1,6 и a-1,4 гликозидные связи в крахмале. При культивировании штамма в глубинных условиях при аэрации в течение 72 ч проявляет активности: амилолитическая 246,0 ед/мл; пуллуланазная 1,6 ед/мл; b-глюканазная 22,0 ед/мл; протеолитическая 20,0 ед/мл. 1 табл.

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-5166 продуцент осахаривающей амилазы, расщепляющей пуллулан.