Штамм @ @ @ -38 продуцент экзо- @ - @ -ацетилглюкозаминидазы Советский патент 1983 года по МПК C12N15/00 C12N9/36 

О5

о да 00

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению нового штамма, используемого для биосинтеза фермента экзо-(Э-М-ацетилглюкозаминидазы.

Известны штаммы-продуценты экзо-Э ацетилглюкозаминидазы, как Bacillus subtilis В., Bacillus сеreus. Bacillus megatherium. Bacillus lichemiformig ClJ,.

Недостатком этих продуцентов является сравнительно низкий уровень эк 3o-/i-N-ацетил глюкоз амида зной активности .

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положитель- 15 ному эффекту к предлагаемому является штамм Bacillus subtilis G-19, который при глубинном культивировании обладает экзо-/3-М-ацетилглюкозаминидазной активностью по колори- 20 метрическому метод и составляет 13 мед/мл 2.

Недостатком штамма является то, что он характеризуется низкой ферментативной активностью при глубин- 25 ном способе культивирования, сама культура мало стабильная, культура не используется при производстве ферментного препарата экзо- -N- jb -ацетилглюкозаминидазы. Штамм 0 Bacillus subtilis G-19 известен как продуцент эндо- и экзо-ацетилглюко3аминида3ы,

Цель изобретения - получение нового высокоочищенного штамма - про- ,г дуцента, сохраняющего стабильность биосинтеза во время глубинного культивирования.

Для получения такого штамма продуцента экзо-р-Н-ацетилглюкозаминидазы были выделены .из природы различные микроорганизмы, способные к биосинтезу данного фермента.

Из вьщеленных штаммов отобран высокоактивный штамм по биосинтезу экзо-/ь-К-ацетилглюкозаминидазы 5 и идентифицирован как Bacillus subtilis G-38.

Полученный новый штамм Bacillus subtilis G-38 продуцент SKSo-p-N-ацетилглюкозаминидазы хр анится в 50 Центральном музее промышленных икроорганизмов института ВНИИгенетика под коллекционным номером: ЦМПМ В-2471,

Культура Bacillus subtilis G-38 55 бладает следующими морфологическии и культурально-физйологическими свойствами. Величина клеток одноуточной культуры на мясопептонном ульоне 1,6-2,7 мк на 0,3-0,5 мк.- 0 летки отличаются большой вариабильостью в отношении размеров. Выращеные на среде с глюкозой или на карофельной среде в мазках под микрокопом они представляются в виде ,,

толстых больших палочек, обычно расположенных в цепочки.Палочки окрашиваются равномерно, подвижные с помощью перетриховых жгутиков, грамположительны,.образуют споры без капсул. Споры обычно эксцентральные, реже расположены в центре Они цилиндрические или эллипсоидальные, размеры 1,1-1,3 мк на 0,5-0,7 мк. Споры Обычно прорастают экваториально путем разрыва мембраны вдоль экватора.

На мясопептонном агаре после односуточной инкубации в термостат при 37°С образуются колонии дйа-. метром 2-7 мм. Они сероватые, непрозрачные, складчатые, в центральной части поверхности колонии верХушка беловато-серого цвета.

На ломтиках картофеля рост культуры довольно обильный, пленка сухая, толстая, морщинистая с продолговатыми складками, серовато-белого цвета.

На мясопептонном бульоне рост особенно характерный,, поверхность бульона покрывается толстой морщинистой желтовато-серой пленкой, а сам бульон остается прозрачным.

Культура Bacillus subtilis G-38 является строго аэробного типа с оптимальной температурой роста 37°С при рН 6,4-6,6. Продуцент Bacilus subtilis G-38 для роста усваивает глюкозу, сахарозу, мальтоз и глюкозамин с образованием кислот без выделения газа, разжижает желатину, гидролизует крахмал. Нитраты восстанавливает до нитритов. На среде Кларка образует ацетилметилкарбонол.

Пример 1. Для выращивания штамма Bacillus subtilis G-38 служит питательная среда следующего состава, г/л воды:

Крахмал45,0

.Калий сернокислый 3,3 Магний сернокислый 0,17 Натрий хлористый 0,3 Кукузурный экстракт 26,0 Аммоний фосфорнокислый 5,0 Марганец сернокислый 1,0 Кальций углекислый 0,13 Питательную среду указанного состава по 100 мл разливают в колбы емкостью 750 мл и стерилизуют при 121°С 30 мин. Стерильную питательную среду с рН 6,5 засевают культурой Bacillus subtilis G-38, выращенной на ломтиках картофеля. Культивирование продуцента проводя на качалках (150-180 качаний/мин при 37°С) . На- 8-12 ч роста экзо-/ -N-ацетилглюкозаминидазная актив- , ность в культуральной жидкости в среднем составляет 16 мед/мл. Актиность зкзо-/з-К-ацетилглюкозаминида

определяют колометрически по интенсивности окраски образовавшегося . п-нитрофенила при энзиматическом расщеплении синтетического субстрата п-нитро-фенил-р-Ы-ацетилглюкозаминида.

Пример 2. Культивирование штамма Bacillus ubtilis G-38 в бродильных ycTaHoikax типа Биоло- фит .

Для культивирования данного продуцента в бродильных установках типа Биолофит емкостью 20 л с объемом 10 л служит питательная среда, состава аналогичного примеру 1. Компоненты питательной среды в Биолофите стерилизуют при 120°С. Стерильную питательную среду (рН 6,5) охлаждают до 37-40С и

засевают споровой культурой Bacillus subtilis G-38, Культивирование проводят при 37°С, аэрация 5 л, размешивании 300 об/мин. Максимальную активность в культуральной жидкости определяют на 7-12 ч роста штамма Bacillus subtilis G-38. Оптимальная активность в культуральной жидкости Составляет 22 мед/мл.

При использовании нового штамма

0 Bacillus subtilis G-38 продуцента экзо-р-Н-ацетилглюкозаминидазы создается возможность увеличить активность данного фермента на 69%.

Экономическая эффективность при

5 широком производственном применении этого штамма составляет 20 тыс.руб. в год.

Штамм Bacillus subtilis G-38 (коллекция Центрального Музея промышленных .микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный но,мер ИМПМ В-2471) - продуцент экзо-|Ь-Ы-ацетилглюкозаминидазы.