Штамм лимфоидной клеточной линии человека Номо SapIeNS, используемый в качестве тест-объекта для изучения действия мутагенных, лекарственных и вирусных препаратов Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биологии и медицине и может бьггь использовано в качестве тест-культуры для изучения действия различных мутагенных и лекарственных препаратов, а также вирусных агентов.

Цель изобретения - получение штамма клеточной линии человека, пригодного для испытания различных лекарственных, мутагенных и вирусных пре- паратов.

Штамм ЛС(ОМ)2 получен в. 1982 г. от больного острым монобластным лейкозом при культивировании лимфоцитов периферической крови, выделенных путем низкоскоростного центрифугирования в градиенте фиколл-верографин.

Штамм ЛИМФОИДНОЙ клеточной линии Homo Sapiens депонирован под номером BCKK(II) № 153Д и характеризуется следующими признаками.

Морфологическая характеристика и культуральные свойства. Штамм ЛС(ОМ)-2 представляет собой лимфоид- ную культуру клеток, которая без существенных изменений фенотипических, морфологических и биологических свойств, размножается в течение 5 лет. Основной особенностью штамма является его способность пролиферировать в суспензионном состоянии в жидкой фазе среды культивирования без признаков прикрепления к стеклу, тктивно метаболизируя питательную среду, с

Сп

СО

о

00

3151

образованием различной формы и вели чины клеточных конгломератов,, видимых невооруженным-глазом. Штамм отличается также пррстотой культивирования так как размножается на питательной среде RPMI 1640 с добавлением 15% инактивированной прогреванием бычьей сыворотки, L-глютамина (300 мкг/мл) и антибиотиков в стационарном состоя- НИИ в обычном термостате при 37°С. Время удвоения клеточной массы 24 ч. Оптимальная концентрация клеток (3-4)х10 кл./мл. Процент живых клеток колеблется в пределах 85-92%. Способ культивирования суспензионный Кратность рассева 1:2-1:3 каждые 5 дней. Клетки хор ошо переносят крио- консервацию. В качестве криопротекто ра .используется диметилсульфоксид в конечной концентрации 8%.

Морфологически штамм состоит из лимфобластов, составляющих 92-95% всей клеточной популяции. Клетки полиморфны, крупные, ядра округлые ил и . овальные и содержат по одной крупной нукпеоле или изредка две мелкие.

Цитогенетическая характеристика. Цитогенетический анализ клеток линии ЛС(ОМ)-2 позволяет выявить наличие -. модального класса с 46 хромосомами. Анеуплоидные в основном, гиподиплоид- ные клетки составляют всего 10%.. Дифференциальная окраска хромосом на С-диски дает возможность устано- вить, что в пределах одного модального класса имеется два клеточных кло- на: , ХУ (нормальный кариотип) и , ХУ, -2, -12, MI М. М, . del 2(р12) и Mj t (2 12), ( ;р13).Второй клон клеток составляет 20% популяции.

Дифференциальная окраска хромосом на С-диски дает возможность найти общий хромосомный маркер для обо- их клонов - инверсию структурного гетерохроматина в одной из 16 хромосом.

Цитохимическая характеристика. Цитохимический анализ клеток штамма ЛС(ОМ)-2 вьивляет их Б-лимфоидную принадлежность, на основании определения высокой пиронинофиллии цитоплазмы, присутствия гранул гликогена определяемого по методу ШИК (реакция Мак-Мануса), отсутствия активности пероксидазы и щелочной фосфатазы. В клетках штамма определяется также

4

высокая активность нафтол AS-ацетат- эстеразы, обнаруживаются липиды. Вирусологическая характеристика.

Электронно-микроскопическая характеристика. Цри исследовании ультратонких срезов клеток штамма ЛС(ОМ)-2 (приготовленных на ультратоме LKB после фиксации клеток штамма 3%-ным раствором глютарового альдегида с последующей дополнительной фиксацией,контрастированием уранилацетатом и цитратом свинца) в электронном микроскопе JEM 100 В выявлены частицы с морфологической структурой вируса герпеса в 0,5% клеток.

Изучение изоэнзимного состава клеток штамма ЛС(ОМ)-2. Для изучения изоэнзимного состава лактатдегидро- геназы (ЛДГ). и глюкозо-6-фосфатдегид- рогеназы (Г6ФДГ) в клетках штамма 10 клеток промывают в растворе Хен- кса, добавляют 100 мкл дистиллированной воды, интенсивно пипетируют, и клеточный детрит осаждают при

12 000 об/мин в течение ,10 мин. Над- осадок используют для тестирования ферментативной активности. Пробы подвергают ЭФ (электрофорезу) в полиак- риламидном геле (7%). После проявления ферментативной активности установлено, что в клетках ЛС(ОМ)-2 ДЦГ пред- ставлена 5 изоэнзимами с различными электрофоретическими подвижностями, что характерно для отряда приматов. Г6ФДГ представлена одним изоэнзимом типа Б, характерным для людей белой расы.

Чувствительность к вирусам. Чувствительность клеток штамма ЛС(ОМ)-2 к парамиксовирусам птиц определена на цримере вируса болезни Ньюкасла и емейству рабдовирусов на примере вируса везикулярного стоматита, серотип Индиана. Клетки штамма не выявляют высокой чувствительности к обоим указанным вирусам.

Пример 1. Клетки штамма в среде RPMI 1640 в сочетании с 15% сыворотки крупного рогатого скота в количестве 5x10 кл./мл расфасовывают в пробирки по 2 мл. Клетки отмывают от сыворотки, осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и к полученному осадку добавляют по 0,2 мл вируса везикулярного стоматита, серотип Индиана, и вируса болезни Ньюкасла. Контакт вирусов с

-515

клетками проводят при в течение 1,5 ч, посде чего вирусы отсасывают, а к клеткам добавляют ростовую среду Опытные и контрольные (вместо вируса вносят питательную среду) пробирки просматривают ежедневно в световом микроскопе. Степень цитопатического действия оценивают по числу мертвых клеток, для чего ежедневно просчитывают их, смешивая суспензию клеток с равным объемом 0,2%-ного раствора трепанового синего.

Результаты представлены в таблице

Как видно из таблицы, клетки штамма не проявляют выраженной чувствительности к указанным вирусам. Это свойство штамма делает его ценным для изучения механизма избирательного действия вирусов на клетки различных штаммов.

Пример 2. Проведено испытание клеточной линии ЛС(ОМ)-2 на чувствительность к антипролифератив- ному действию рекомбинантного интерферона (/.2 . Клеточную культуру выращивают в.среде RPMI с добавлением 10%-фетальной сыворотки коров; в опыте используют 1-суточную культуру .в концентрации.3 ./мл. Исходная концентрация интерферона составляет 1 мкг/мл. В 96-ячеечной пластине го30316

товят 2-кратные разведения интерферона в среде для выращивания клеток (с 1:2 по 1:128) в объеме 50 мкл, используя по 3 лунки на каяодое разведение. Затем в каждую лунку вносят по 50 мкл суспензии клеток. На 3-й сутки инкубации при 37°С в термо10

стате с 5% СО клетки подсчитывают в камере Фукса-Розенталя. Процент ин- гибиции подсчитывают по формуле

К-0

К

100, где К - количество клеток

в контроле; О - количество клеток в опыте. При концентрации интерферона 500 нг/мл ингибиция составляет 70%, при 125 нг/мл - 50%, при 31,25 нг/мл - 31%, что свидетельствует о высокой

чувствительности данной клеточной линии к антипролиферативному действию интерферона. Таким образом, данная линия представляет интерес в изучении механизма антипролиферативного дейстВИЯ интерферона.

Формула изоб р етения

Штамм лимфоидной клеточной линии че- овека Homo Sapiens BCKK(II) № 153Д, используемый в качестве тест-объекта для изучения действия мутагенных, лекарственных и вирусных препаратов.

Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано в вирусологии и молекулярной биологии. Цель изобретения - получение штамма клеточной линии человека, пригодного для испытания различных лекарственных, мутагенных и вирусных препаратов. Штамм депонирован под номером ВСКК(П)N153Д. Штамм получен при культивировании лимфоцитов периферической крови больного острым монобластным лейкозом. Кариотип клеток в части случаев нормальный, а в части случаев патологический, имеется два маркера, что позволяет использовать штамм как тест-культуру для изучения механизма действия вирусов, канцерогенов, а также лекарственных препаратов. 1 табл.

ВИРУС везикулярного стоматита Вирус болезни

10

20

29

33

40