Штамм культивируемых клеток павиана гамадрила PapIo НамаDRYLаS, используемый для получения лимфотропного ретровируса павианов типа С и в качестве тест-объекта для характеристики моноклональных антител Т-клеточной специфичности Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть использовано

в онковирусологических исследованиях и биотехнологии в качестве источника Т-лимфотропного ретровируса обезьян типа С (SI LV-I), а также в качестве тест-обьекга для выявления антигенов и характеристики мо- ноклональных антител (МонАТ) Т-клеточной специфичности.

Аналогом изобретения является 1- лимфоидная культура клеток человека МТ 2-продуцент вируса Т-клеточного леико- за/лимфомы человека типа 1(Н1 LV-I) 3. Аналог был получен громоздким методом - путем сокультивирования лейкемических клеток крови больного Т-клеточпой лейкемией с лимфоцитами пупочного канатика человека. Клетки штамма, хотя и имеют хел- перный фенотип, но идентифицированы с использованием ограниченного набора маркеров 5 Кроме того, в клетках аналога реплицируется вирус HTLV-I j 1, сходный, но не идентичный ретровирусу С-типа обезьян STLV-l 2,

Прототипом изобретения является штамм культивируемых клеток павиана гамадрила Рарю hamadryas (ВПЛ-П)-проду- цент лимфотропного герпесвируса и ретровируса типа C(STLV-I) 6, полученный в результате трансформации нормальных лимфоцитов клинически здоровых павианов лимфотропным герпесвирусом павианов (ГВП) и продуцирующий два типа лимфот- ропных онкогенных вирусов (ГВП и STLV-I), что существенно осложняет его использование в области экспериментальной онкологи Клегки прототипа имеют также В клеточное происхождение и непригодны для тестирования МонАТ Т-клеточной спе цифичности.

В связи с указанным целью изобретения является получение стабильною штамма Т-лимфоиднои линии павиана гамадрила с его практическим использованием в каче- стве источника чистой культуры Т-лимфог- ропиого ретровируса С-типа S1LV-I, а также в качестве тест-объекта для выявления антигенов Г-клеточной специфичности и характеристики МонА к различным эпитопам рецепторов Т-клеток

Штамм был получен путем культивирования мононуклеарной клеточной фракции селезенки павиана гамадрила № 13583, погибшего от Т-клеточной лимфомы Мононук- леары селезенки были выделены путем низкоскоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографпна, дважды отмыты и ресуспендирочаны в питательной среде RPMI 1640 в сочетании с 15% инактивированной прогреванием при 56°С 30 мин сыворотки плода коров в присутствии 300 мкг/мл 1-глюгамина, М 2-мер каптоэтанолэ, 100 ед/мл пенициллина,,100 мкг/мл стрептомицина и 20 мкг/мл конканавалина A (Con А). Через 48 ч клетки осаждали, отмывали, ресуспендировали в питательной смеси указанной рецептуры (без Con А) и добавляли 100 ед/мл рекомбинан- тпого интерлейкина-2 (р /1Л-2, МНТК Био- ген). Добавление новых порций рИЛ-2 проводили через каждые 72 .ч культивирования. Культуру инкубировали в термостате при 37°С в газовоздушной смеси, содержащей 5% С02, при 100% влажности Лимфоб- ластоидная трансформация и становление культуры произошли на 37 день культивирования.

1.Культуральные свойства и морфологическая характеристика.

Штамм СПГ-7(Т) является суспензионной культурой, клетки которой находятся в жидкой фазе и растут без прикрепления к твердому субстрату. Ростовые характеристики клеток штамма следующие: время удвоения клеточной массы составляет 28-30 ч, максимальная клеточная плотность - 6- 8x10° кл/мл, число мертвых клеток колеблется в пределах 5-20%, посевная доза составляет 1,5-2х10ь кл/мл,

Клетки штамма хорошо переносят крио- консервацию. В качестве криопротектора используют 8%-ный диметилсульфоксид в эмбриональной сыворотке коров.

Штамм представлен одиночными лим- фоидными клетками и их небольшими скоплениями. При окраске препаратов клеток по РомановскомуТимза выявляется морфологическая структура лимфобластОв Клетки в основном крупные с большим ядром и нежно-голубой цитоплазмой В ядрах клеток определяются нуклеолы.

2,Цитогенетическая характеристика.

Цитогенетический анализ, проводимый методом окраски хромосом на G-диски, выявил наличие нормального кариотипз пави- ака гамадрила (2л 42,хх) при модальном -классе хромосом, равным 42/30, и плоидно- сти клеток (п - 300), равной 13,9%

З.Характеристика вмрогенного статуса клеток штамма.

а) Методом блот-гибридизации по Сау- зерну в клетках штамма СПГ-7(Т) была определена провирусная ДНК STLV-I, гомологичная провирусной ДНК HTLV-I из HTLV-i-продуцирующих клеток МТ-4, но отличающаяся от нее по сайтам рестрикции ДНК. Количество интегрированной провирусной ДНК STLV-I составляет 0,5- 1 геном- эквивалента на клетку. При этом имеет место моноклональпый характер интеграции провирусной ДНК в клеточный геном В свою очередь провирусная ДИК STLV-I мз клеток СПГ-7(Т) имеет такжб некоторые раз- шчия в сайтах рестрикции ДНК от провирусной ДНК STLV-I в клетках прототипного штамма ВПЛ-П 6.

б)В ультрацентрифугате культуральной жидкости штамма СПГ-7(Т) методом имму- ноблотинга с использованием HTLV-l-поло- жительной сыворотки человека, больного синдромом АГ1(Т-клеточная лейкемия/лим- фома взрослых, обнаружены основные структурные белки gag-комплекса STLV-I (р24 и р19, идентичные соответствующим белкам HTLV-I).

в)Определение РНК-зависимой ДНК- полимеразы проводили, используя ультра- центрифугат культуральной жидкости СПГ-7(Т). Было показано, что фермент пред- почитает ионы , а не , что характерно для вирусов этой группы.

4.Иммунологическая характеристика клеток штамма СПГ-7(Т).

Клетки штамма имеют Т-клеточный фе- нотип, так как более 80% клеток содержат пан-Т-клеточные антигены CD2, выявляемые МонАТ этого кластера (9.6, 7P4-7F10) и CDS (SP34), и не несут пан-В-клеточных антигенов кластера CD20(fF15)

В клетках штамма с высокой частотой обнаруживаются С04-антигены, выявляемые с помощью МонАТ 19Thy-5D7 и МТ310 и не содержатся антигены кластера CD8 (MoATG10-1 H7PT-3F9)

Пример 1. Использование штамма СПГ-7(Т) в качестве источника ретровируса С-типа STLV-I.

Кульгуральная жидкость штамма СПГ- 7{Т) в объеме 1 л освобождалась от клеток центрифугированием при 1500gv 15 мин и далее при ЮОООд, 10 мин Вирус осаждали при 5000д,4 ч, + 4°С. Осадок ресуспендиро- вали в 1 мл буфера THE (0,01 М Tris-HCI, pH 7,2; 0,1 М NaCI; 0,001 М EDTA) и центрифу- тировали при 25000 об/мин, 17 ч, ротор SW28, Векман. Содержимое градиента фракционировали и собирали зону с плотностью 1,15-1,17 г/см3 Материал разбавляли

3раза буфером THE и вирус осаждали при 200000д, 1 ч Вирусный осадок ресуспенди- ровали в 1 мл буфера THE и хранили при - 70°С.

В осадке методом детекции ревертаз- ной активности определяли наличие вирио нов STLV-K К 100 мкл вирусной суспензии добавляли 10 мкл Nonidet P-40 и 10 мкл лизата смешивали с 90 мкл реакционной смеси, содержащей 40 мМ Tris-HCI. pH 7,8;

4тМ дитиотрейтола, 45 mM KCI 0,25 ОЕ260 поли(рА)олиго(дТ), 15 мкм 3Н-ТТФ (уд. а,кт,

18 Кю/мМ), 10 мМ MgCI или 0,25 мМ MnCte. Инкубацию проводили при 37°С в течение 1

ч. Кислотонерастворимую радиоактивность измеряли в толуоловом сцинтилляторе на сцинтилляционном счетчике SL4000 (Интертехник, Франция). Ревертазную реакцию считали положительной, если включение / Н-ТТФ в пробу было в 2 и более раз выше, чем в образце без добавления синтетической матрицы-затравки (см табл.1)

Таким образом показано что штамм СПГ-7(Т) является источником ретровируса С-типа павианов гамадрилов STLV-I.

Пример 2. Использование клеток штамма СПГ-7(Т) для тестирования МонАТ Т-клеточной специфичност1,,,

Клетки штамма СПГ-7(Т) тестировали с применением МонАТ к различным антигенам Т-клеток в реакции непрямой иммуноф- люоресценции в модификации для монослоя живых клеток, прикрепленных к сгеклу полиЬ-лизином. Клетки в концентрации 1,5 млн. кл/мл наносили на стекла в лунки по 50 мкл. Предварительно стекла инкубировали с поли -лиз-ином (50 мкг/мл) 30 мин при 37°С и затем дважды отмывали в фосфатно-буферном растворе (ФБР) Клетки инкубировали с полмЬ-лизином 30 мин при 37°С, отсасывали культуральную жидкость и наносили МонАТ Инкубировали 30 мин при + 4°С, после чего клетки отмывали 5 раз в ФБР, содержащем 0,1% NaNs, и наносили вторую козью антимышиную сыворотку F(ab )2, коныогированную ФИТЦ (Тадо, США), в рабочем разведении 1 40 После контакта коньюгат отмывали 5 раз ФБР с 0,1% №N3, после чего клетки заключали в 50%-ныи раствор глицерина, приготовленного на ФБР (рН 7,2-7,4) Препараты исследовали в люминесцентном микроскопе Opton (ФРГ), просчитывая не менее 200 клеток. Клетки с яркой поверхностной флюоресценцией считались положительными. Результаты эксперимента приведены в табл.2.

Как следует изданных, представленных в табл.2, клетки штамма выявляют широкий диапазон Т-клеточных маркеров и пригодны для тестирования МонАТ Т-клеточной принадлежности.

Формула изобретения

Штамм культивируемых клеток павиана гамадрипа Papio Hamadrylas BCKK(II) №504 Д, используемый для получения лимфотроп- ного ретровируса павианов типа Сив качестве тест-объекта для характеристики моноклональных антител Т-клеточной спе- иифичности.

Таблица 1

Использование: биотехнология, экспериментальная онкология. Сущность: получение штамма культивируемых клеток павиана гамадрила Papio Hamadryas, продуцирующего лимфотропный ретровирус павиана типа С. Штамм может быть использован и для тестирования Моноклональных антител Т-клеточной специфичности. Штамм получают путем .культивирования мононуклеарной клеточной фракции селезенки павиана гамадрила в присутствии ре- комбинантного интерлейкина - 2(рИЛ-2). Более 80% клеток штамма имеют антигенные маркеры СД2 и СД4. На 90% клеток обнаружены рецепторы к рИЛ-2. 2 табл. (/ С ««А vi XI W

Результаты тестирования ревертазной активности

Примечания:

имп/мин пробы

Индекс ревертазной активности р(Лы

без матрицы

- В-клеточная линия человека, продуцирующая герпесвирус Эп- штейна-Барр.

Иммунофенотип клеток штамма СПГ-7(Т)

МонАТ 9,6 7Р4- «РЗ 19Thy-MTCIO-1 7РТ- 9.3 ШНД37 1FS2СЗ 1яС LxL

7F105D7310-3F9

t клеток 91 80 81 80720,5 3 68 901,5 2,000ОО

Таблица 2