СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРИСТОЛОХИЕВЫХ КИСЛОТ Советский патент 1995 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности.

Аристолохиевые кислоты обладают противоопухолевым действием. Комплекс аристолохиевых кислот входит в состав растения кирказон маньчжурский Aristolochia manshuriensis Kom.

Цель изобретения увеличение выхода целевого продукта и получение воспроизводимого источника сырья.

Способ состоит в том, что для получения аристолохиевых кислот, продуцируемых растением Aristolochia manshuriensis, включающего экстрагирование их из сухого сырьевого материала, в качестве сухого материала используют каллусы Aristolocgia manshurinsis, которые индуцируют из эксплантатов интактного растения и культивируют первоначально на инициальной питательной среде следующего состава, мг/л воды: NH₄NO₃ 1145-1850 KNO₃ 1490-2100 CaCl₂ ˙ 2H₂O 420-500 MgSO₄ ˙ 7H₂O 350-400 KH₂PO4 150-210 Н₃БО₃ 4,2-8,0 MnSO₄ ˙ 4H₂O 15,6-26,7 ZnSO₄ ˙ 7H₂O 6,0-10,3 KI 0,53-0,90 Na₂MoO₄ ˙ 2H₂O 0,15-0,30 CoCl₂ ˙ 5H₂O 0,030-0,075 FeSO₄ ˙ 7H₂O 25,0-30,0 Na₂EDTA ˙ 2H₂O 26,1-40,1 CuSO₄ ˙ 5H₂O 0,030-0,075 Тиамина гидро- хлорид 0,15-0,25 Пиродоксина гидро- хлорид 0,40-0,60 Никотиновая кислота 0,40-0,60 Мезо-инозит 50,0-100,0 L-Цистеина гидро- хлорид 4,0-6,0 6-Бензиламино- пурин 0,2-1,0 Индолилуксусная кислота 1,0-3,0 Сахароза 2,5 ˙ 10⁴-3,5 ˙ 10⁴ Бакто-агар 5,5 ˙ 10³-6,5 ˙ 10³ при рН 5,2-6,2 с последующим отбором наиболее продуктивных каллусных линий, которые затем культивируют на продукционной питательной среде, активизирующей синтез аристолохиевых кислот следующего состава, мг/л воды: KNO₃ 1900-4400 CaCl₂ ˙ 2H₂O 110-1470 MgSO₄ ˙ 7H₂O 350-400 KH₂PO₄ 150-210 H₃BO₃ 4,2-8,0 MnSO₄ ˙ 4H₂O 15,6-26,7 ZnSO₄ ˙ 7H₂O 6,0-10,3 KI 0,53-0,90 Na₄MoO₄ ˙ 2H₂O 0,15-0,30
CuSO₄ ˙ 5H₂O 0,03-0,075 CuCl₂ ˙ 2H₂O 0,03-0,075 FeSO₄ ˙ 7H₂O 25,0-30,0
Na₂EDTA ˙ 2H₂O 32,6-50,1 Тиамина гидро- хлорид 0,15-0,25 Пиридоксина гидро- хлорид 0,40-0,60 Никотиновая кислота 0,40-0,60 Мезо-инозит 50,0-100,0 L-Цистеина гидро- хлорид 4,0-6,0 6-Бензиламино- пурин 1,0-5,0 Индолилуксусная кислота 0,5-1,0 Сахароза 3,5 ˙ 10⁴-4,5 ˙ 10⁴ Бакто-агар 5,5 ˙ 10³-6,5 ˙ 10³ при рН 5,6-5,8.

Инициальная среда составлена на основе прописи Мурасиге и Скуга с необходимыми изменениями. В табл.1 приведены составы сред Мурасиге-Скуга и инициальной.

При инкубации эксплантатов А.manshuriensis на среде Мурасиге-Скуга получаются первичные слабые каллусы, которые некротизируют при пересадке. После изучения каждого компонента питательной среды по отдельности, испытывая в каждом опыте его развертку (макро- и микросоли оставлены по прописи Мурасиге-Скуга), получили указанные выше среды.

Приведены прописи сред с минимальными, средними и максимальными содержаниями ингредиентов. Эти содержания соответствуют концентрации веществ в интервале их оптимального действия.

В табл.2 приведены основные изменения по сравнению с первоначальной средой Мурасиге-Скуга и причины, по которым эти изменения были сделаны.

Продукционная среда разработана на основе инициальной и модифицирована для синтеза аристолохиевых кислот. При разработке продукционной среды каждый ингредиент испытывался отдельно, при этом определялась его лучшая концентрация. Затем выяснялись взаимодействия компонентов среды путем постановки полных факторных экспериментов ПФЭ 2⁴. На основе этих опытов среды оптимизировались. Ниже приведены следующие основные отличия продукционной среды от инициальной.

Исключен нитрат аммония, так как это вещество ингибирует синтез апристолохиевых кислот, нитрат калия вносится в концентрации 1900-4400 мг/л; хлористый кальций вносится в концентрации 110-1470 мг/л; комплекс железо ЭДТА дается в молярном соотношении 1:1,25, а не 1:1 (как в инициальной среде) для предупреждения выпадения осадка фосфата железа, количество 6-бензиламинопурина увеличено до 1-5 мг/л, а индолилуксусной кислоты снижено до 0,5-1,0 мг/л, количество сахарозы увеличено до 35-45 г/л.

П р и м е р ы 1-3. Однолетние побеги дикорастущей лианы кирказона маньчжурского, собранные в июне 1986 года в Надеждинском районе Приморского края, стерилизуют в 0,2%-ном растворе диоцида (этанолмеркурия хлорид и цетилпиридиния хлорид) в течение 8 мин. После трехкратного отмывания в стерильной дистиллированной воде из побегов вычленяют эксплантаты диаметром 4-5 и толщиной 2-3 мм. Эксплантаты помещают в пробирки 200 х 20 мм, содержащие по 20 мл инициальной среды с минимальными, средними и максимальными значениями ингредиентов, по 10 эксплантатов на каждый вариант среды. Используются питательные среды указанного выше состава.

Через 10 дней культивирования в темноте при 25^оС и относительной влажности воздуха 70% из эксплантатов образуется по 7 первичных каллусов на каждой среде (количество образующихся каллусов составляет 70 + 10% от числа эксплантатов).

Через месяц со дня посадки каллусы отделяют от эксплантата и среды инициации и пассируют на свежие питательные среды такого же состава для получения устойчивых каллусных линий и достижения необходимого масштаба и размножения каллусов. Полученные каллусные линии содержат 0,03 ± 0,01% аристолохиевых кислот от сухой массы. Затем активируют синтез аристолохиевых кислот путем культивирования полученных каллусов на продукционной среде, также выполненной в трех вариантах с минимальным, средним и максимальным значениями ингредиентов. Для этого каллусы разрезают в стерильных условиях на инокуляты размером 4 х 4 х 5 мм, что соответствует начальной массе 80 мг. Полученные инокуляты помещают в пробирки 200 х 20 мм, содержащие по 20 мл продукционной среды с минимальными, средними и максимальными значениями ингредиентов, по 20 инокулятов на каждый вариант. Используют питательные среды указанного выше состава.

Культуры инкубируют в климатической камере при 25^оС и относительной влажности воздуха 70% в темноте в течение 7 недель, за это время в каллусах накапливается максимальное количество аристолохиевых кислот (1 1,2 мг на каллус).

По истечении периода культивирования каллусы извлекают из культуральных сосудов, высушивают при 60^оС в течение 24 ч и взвешивают. Получают 5,0 г сухих каллусов со среды, имеющей средние значения ингредиентов. Эти каллусы измельчают до размера частиц 1-2 мм и экстрагируют трехкратно по 50 мл метиловым спиртом в течение 9 дней, по три дня каждая экстракция. Извлечения объединяют и после фильтрации отгоняют растворитель при пониженном давлении, используя ротационный испаритель. Получают густой коричневый сироп, который растворяют в 150 мл бутилового спирта. Полученный раствор экстрагируют пятикратно по 50 мл насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия. Объединенные щелочные извлечения подкисляют до рН 7 5%-ным раствором соляной кислоты и вновь экстрагируют тремя порциями по 50 мл бутилового спирта. Экстракты выпаривают под вакуумом досуха и получают 27,5 мг аристолохиевых кислот.

Подобным образом проводят выделение аристолохиевых кислот из каллусов, выращенных на средах, имеющих минимальные и максимальные содержания ингредиентов. В табл.3 представлены результаты получения аристолохиевых кислот по известному и данному способам.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить выход аристолохиевых кислот.

Преимущество предлагаемого способа состоит в том, что он позволяет получить постоянно воспроизводимый источник сырья для выработки аристолохиевых кислот, а также открывает возможность повышать содержание целевого продукта относительно интактного растения путем селекции продуктивных каллусных линий. Кроме того, использование предлагаемого способа позволит избежать уничтожения редкого растения Arictolochia manshuriensis при использовании его в качестве сырья.

Работы по получению культуры каллусов Aristolochia manshuriensis начались в марте 1986 года. Материал части растения Aristolochia manshuriensis заготавливался в следующих местах:
Надеждинский район Приморского края, река Нежинка, 22 км западнее села Нежино;
Уссурийский район Приморского края, Горно-таежная станция ДВО АН СССР;
Приморский край, г.Владивосток, Ботанический сад ДВО АН СССР.

Материал заготавливался ежемесячно в течение полутора лет. Часть его использовалась для получения каллусов, другая часть для химического анализа и фармакологических испытаний.

В течение полутора лет проводились опыты по получению каллусов, в результате которых выявлена сезонная динамика каллусообразования. Каждая каллусная линия анализировалась на содержание аристолохиевых кислот. Анализ содержания аристолохиевых кислот проводился в Биолого-почвенном институте и параллельно в Тихоокеанском институте Биоорганической химии. Результаты количественных определений содержания аристолохиевых кислот в тканях интактных растений и в каллусах представлены в табл.4. Отмечается высокая стабильность содержания аристолохиевых кислот в интактных дикорастущих растениях. Так, их содержание в растениях из Надеждинского района составляет 0,29-0,36% из Уссурийского района 0,29-0,34% из пригорода Владивостока 0,28-0,36% Растения в январе содержат 0,32-0,34% аристолохиевых кислот, в апреле 0,34-0,36% в июле 0,29-0,30% а в октябре 0,28-0,31%
Во всех каллусных культурах также накапливается примерно одинаковое количество аристолохиевых кислот. Содержание их в каллусах, полученных от растений из Надеждинского района, составляет 0,52-0,66% из Уссурийского района 0,46-0,69% из пригорода Владивостока 0,45-0,61% Каллусы из растений, собранных в январе, содержат 0,46-0,52% аристолохиевых кислот, в апреле 0,53-0,66% в июле 0,45-0,69% в октябре 0,40-0,66%
Таким образом, приведенные результаты количественного определения содержания аристолохиевых кислот в тканях интактных растений, заготовленных в различное время года и в различных местах, и в каллусных тканях, полученных из этих растений, показывают, что из содержащих примерно равные количества аристолохиевых кислот дикорастущих растений получаются каллусы, также содержащие примерно одинаковые количества аристолохиевых кислот.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности. Аристолохиевые кислоты, обладающие противоопухолевым действием, содержатся в растении кирказон маньчжурский. Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта и получение воспроизводимого источника сырья. Способ состоит в том, что для получения аристолохиевых кислот используют каллусы растения Aristolochia menshuriens, полученные при культивировании ткани на специально подобранных питательных средах при специфических условиях культивирования. 4 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРИСТОЛОХИЕВЫХ КИСЛОТ, включающий экстрагирование их растворителем из растительного сырья, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и получения воспроизводимого источника сырья, в качестве растительного сырья используют каллусы Aristolochia manshuriensis, которые индукцируют из эксплантатов интактного растения и культивируют первоначально на инициальной питательной среде следующего состава, мг/л воды:
NH₄NO₃ 1145 1850
KNO₃ 1490 2100
CaCl₂ · 2H₂O 420 500
CuSO₄ · 5H₂O 0,030 0,075
MgSO₄ · 7H₂O 350 400
KH₂PO₄ 150 210
H₃BO₃ 4,2 8,0
MnSO₄ · 4H₂O 15,6 26,7
ZnSO₄ · 7H₂O 6,0 10,3
KI 0,53 0,90
Na₂MoO₄ · 2H₂O 0,15 0,30
CoCl₂ · 5H₂O 0,030 0,075
FeSO₄ · 7H₂O 25 30
Na₂EDTA · 2H₂O 26,1 40,1
Тиамина гидрохлорид 0,15 0,25
Пиридоксина гидрохлорид 0,4 0,6
Никотиновая кислота 0,4 0,6
Мезоинозит 50 100
L-цистеина гидрохлорид 4 6
6-Бензиламинопурин 0,2 1,0
Индолилуксусная кислота 1 3
Сахароза 2,5 · 10⁴ 3,5 · 10⁴
Бакто-агар 5,5 · 10³ 6,5 · 10³
при pH 5,2 6,2
с последующим отбором наиболее продуктивных каллусных линий, который затем культивируют на продукционной питательной среде, активизирующей синтез аристолохиевых кислот, следующего состава, мг/л воды:
KNO₃ 1900 4400
CaCl₂ · H₂O 110 1470
MgSO₄ · 7H₂O 350 400
KH₂PO₄ 150 200
H₃BO₃ 4,2 8,0
MnSO₄ · 4H₂O 15,6 26,7
ZnSO₄ · 7H₂O 6,0 10,3
KI 0,53 0,90
Na₂MoO₄ · 2H₂O 0,15 0,30
CuSO₄ · 5H₂O 0,030 0,075
CaCl₂ · 2H₂O 0,030 0,075
FeSO₄ · 7H₂O 25 30
Na₂EDTA · 2H₂O 32,6 50,1
Тиамина гидрохлорид 0,15 0,25
Пиридоксина гидрохлорид 0,4 0,6
Никотиновая кислота 0,4 0,6
Мезо-инозит 50 100
L-цистеина гидрохлорид 4 6
6-Бензиламинопурин 1 5
Индолилуксусная кислота 0,5 1,0
Сахароза 3,5 · 10⁴ 4,5 · 10₄
Бакто-агар 5,5 · 10³ 6,5 · 10³
при pH 5,6 5,8.