Штамм каллусной культуры АRISтоLоснIа маNSнURIеNSIS - продуцент аристолохиевых кислот Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

t

(21)4425856/31-13

(22)12.05.88

(46) 23.03.90. Бюл. N 11

(71)Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения АН СССР

(72)В.П.Булгаков и Ю.Н.Журавлев

(53)663.15(088.8)

(56)Тахтаджян А.Н ласти земли. - Л.,

Phytorhemistry, р. 1759-1762.

(54)ШТАММ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ ARI- STOLOCHIA MANSHURIENSIS - ПРОДУЦЕНТ АРИСТОЛОХИЕВЫХ КИСЛОТ

(57)Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности. Целью

Флористические об- 1978, 247 с. 1982, v. 21, № 7,

изобретения является новый штамм культуры многолетней лианы (кирказона маньчжурского) Aristolochia manshu- riensis BCKK-BP № 33 (лабораторный номер А.), обладающий способностью к росту, размножению и одновременному синтезу аристолохиевых кислот. После 49 сут культивирования на агариэо- ванной среде выход сухой массы кал- лусов с одной культуральной колбы составляет 540-750 мг. Содержание аристолохиевых кислот в культуре 0,24-0,60%, из них аристолохиевые кислоты 1 и 4 составляют 0,21-0,54%, а аристолохиевые кислоты Д и ее D-глюкозид 0,03-0,15% от сухой массы каллусов. 1 табл.

i

(Л

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности. Целью изобретения является новый штамм культуры многолетней лианы (кирказона маньчжурского)ARISTOLOCHIA MANSHURIENSIS ВСКК-ВР N 33 (ЛАБОРАТОРНЫЙ НОМЕР A₁), ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ К РОСТУ, РАЗМНОЖЕНИЮ И ОДНОВРЕМЕННОМУ СИНТЕЗУ АРИСТОЛОХИЕВЫХ КИСЛОТ. ПОСЛЕ 49 СУТ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА АГАРИЗОВАННОЙ СРЕДЕ ВЫХОД СУХОЙ МАССЫ КАЛЛУСОВ С ОДНОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ КОЛБЫ СОСТАВЛЯЕТ 540-750 МГ. СОДЕРЖАНИЕ АРИСТОЛОХИЕВЫХ КИСЛОТ В КУЛЬТУРЕ 0,24-0,60%, ИЗ НИХ АРИСТОЛОХИЕВЫЕ КИСЛОТЫ 1 И 4 СОСТАВЛЯЮТ 0,21-0,54%, А АРИСТОЛОХИЕВЫЕ КИСЛОТЫ Д И ЕЕ Β=D-ГЛЮКОЗИД -0,03-0,15% ОТ СУХОЙ МАССЫ КАЛЛУСОВ. 1 ТАБЛ.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности.

Целью изобретения является новый штамм каллусной культуры многолетней лианы (кирказона маньчжурского) Aristolochia manshuriensis Kom , обладающий способностью к росту, размножению и одновременному синтезу аристолохиевых кислот.

Штамм Aristolochia manshuriensis А, получен селекцией каллусной ткани кирказона маньчжурского. Хранится в специализированной коллекции культивируемых клеток высших растений ВСКК-ВР Института физиологии растений имени К.А.Тимирязева под № 33 и характеризуется следующими признаками.

Морфологические и цитологические признаки. Растущая каллусная культура представляет собой ткань плотной консистенции желто-коричневого цвета. Имеет слабый запах эфирных масел, горьковатый вкус. На разрезе ткань бело-желтого цвета, упругая, часто содержит зоны желтой окраски. Популяция состоит из клеток мерис- темного типа овальной формы. Длина клеток 18-48 мкм, ширина 9-24 мкм. Клетки содержат хорошо различимую цитоплазму, при окраске ацетокарми- ном видны ядра размером 6-8 мкм, содержащие интенсивно окрашенные ядрышки и хромоцентры. Максимум митоти- ческой активости наблюдается на 17-й день культивирования. Количество клеток, %: имеющих 28 хромосом (диплоСПСЛ

J

СО О5

идный .набор) 32-40; 24 хромосомы 22- 26; менее 24-х хромосом 24-28; более 28 хромосом 8-14.

Физиологические признаки. Цикл вы ращивания характеризуется S-образной кривой с лаг-фазой (до 7 сут), фазой экспоненциального роста (7-21 сут), линейной фазой (21-42 сут), фазой замедления роста (42-49 сут) и ста- ционарной фазой (49-56 сут).

Ростовой индекс культуры при выращивании на агаровой питательной среде за 49 сут роста составляет 19,9- 20,7 для каллусов начальной массой 60 мг, содержание сухого вещества 10-12%.

Фитохимическая характеристика. Штамм является продуцентом аристоло- хиевых кислот - веществ, обладающих противоопухолевым действием. Суммарное содержание аристолохиевых кислот в культуре составляет 0,24-0,60 от сухой массы. При этом содержание аристолохиевых кислот 1 и 4 составля ет 75-90% от общего количества кислот, а содержание аристолохиевой кислоты Д и ее 6-В-гликозида 25-10%.

Пример. В колбы Эрленмейера на 300 мл разливают по 75 мл агариэо ванной питательной среды при рН 5,6 следующего состава, мг/л:

Нитрат калия 2500

Сульфат аммония 170

Дигидрофосфат калия 170

Хлорид кальция,

2-х води.440

Сульфат магния,

7-и води.370

Борная кислота 6,2

Сульфат марганца,

4-х води.23,3

Сульфат меди, 5-и

води.0,025

Хлорид кобальта,

2-х води.Р.025

Сульфат цинка,

7-и води.8,6

Молибдат натрия,

2-х води,0,25

Иодид калия0,82

Сульфат железа,

7-и води.27,8

Динатриевая соль

ЭДТА, 2-х води. 37,3

Q

5

5

Гидрохлорид тиамина 0,2 Гидрохлорид пири- доксина0,5

Никотиновая кислота 0,5 Гидрохлорид цистеина 5,0 мезо-Инозит100

Гидролизат казеина 50 6-Бензиламинопурин 1 Индолилуксусная кислота1

Сахароза35000

Агар6000

Дистиллированная водаДо 1 л

Колбы со средой стерилизуют при 117 С в течение 20 мин, затем в асептических условиях в каждую колбу помещают по три инокулята, которые изолируют из исходного каллуса в виде кубиков со сторонами 4 мм. Начальный вес каждого инокулята 60 мг. Колбы с культурами инкубируют в темноте при 25±1°С и относительной влажности воздуха 70±10% в течение 49 сут. Выросшую биомассу высушивают и характеризуют по росту и содержанию аристолохиевых кислот.

После 49 сут культивирования выход сухой массы каллусов с одной культуральной колбы составляет 540- 750 мг. Содержание аристолохиевых кислот в культуре 0,24-0,60%, из них аристолохиевые кислоты I и 4 составляют 0,21-0,54%, а аристолохиевые кислоты Д и ее |Ь-В-глюкозид 0,03- 0,15% от сухой массы каллусов.

Характеристика полученных партий каллусных культур представлены в таблице.

Полученный штамм Aristolochia manshuriensis BCKK-BP № 33 позволяет при выращивании на одной питательной среде получить одновременно с хорошим ростом высокое содержание аристолохиевых кислот. Содержание аристолохиевых кислот в клетках штамма превышает их содержание в ин- тактном растении в 1,3 раза.

Ф ормула изобретения

I

Штамм каллусной культуры Aristolochia manshuriensis ВСКК-ВГ № 33 - продуцент аристолохиевых кислот.

Касса сухой ткани, мг на один культураль- ных сосуд

660 600 540 660 750 600 630 570

Содержание аристолохиевых кислот, % от сухой массы ткани

-

Аристоло- хиевая кислоты Д и ее глю- козид

Общая сумма

0,06 0,15 0,10 0,04 0,03 0,08 0,04 0,06

0,60 0,60 0,55 0,35 0,24 0,40 0,35 0,50