Штамм культивируемых клеток растений АRISтоLоснIа маNSнURIеNSIS Ком., используемый для получения препарата, обладающего кардиотропной активностью Советский патент 1992 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности.

Впервые Arlstolochla manshurlensls Кот. введена в культуру в форме штамма AI, который специализирован для биосинтеза аристолохиевых кислот, веществ противоопухолевого действия и кардиотропной активностью не обладает.

Таким образом, предлагаемый штамм Аа, используемый для получения препарата, обладающего кардиотропной активностью, аналогов не имеет.

Цель изобретения - получение активно растущего штамма клеток кирказона маньчжурского, обладающего кардиотропной активностью.

Штамм Aristolochia manshuriensis (А2) получен в результате генетической трансформации клеток кирказона и депонирован во Всесоюзную коллекцию клеток высших растений ВСКК(ВР) при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР под коллекционным номером 37.

Описание исходного материала. Исходным материалом для получения штамма А2 были пробирочные стерильные растения Aristolochia manshuriensis, выращенные из почек многолетней дикорастущей лианы, заготовленной в декабре 1986г. в Надеждинском районе Приморского края. Штамм А2 получен из дисков стерильных пробирочных растений, инокулированных агробактериями Agrobacterium tumefaciens С 58. и представляет собой культуру трансформированныхгормононезависимыхопухолевыхклеток, выращиваемую на агаризованной либо в жидкой среде.

Культуральные свойства..Растуа1ая каллусная культура представляет собой ткань рыхлой консистенции кремового и беложелтого цвета без запаха. Ростовой индекс 31 ± 0,6 для каллусов начальной массой 150 мг. Растущая в жидкой питательной среде культура представлена агрегатами кремового цвета размером 1-3, реже 3-5 мм. Накопление биомассы 200-250 г сырого веса на 1 л при посевной дозе 40 г/л. Штамм Аг выращивают при 25 ± , относительной влажности воздуха 70% в темноте на питательной среде следующего состава, мг/л воды:

NH4N03350-450

KN031500-2300

КН2Р04150-190

6Н20600-730

MgSO-i 7Н20350-400

НзВОз4,2-8.0

MfiS04 4Н2О15,6-26,7

CuS04 5Н200.02-0,03

CoCl2 2Н200,02-0,03

ZnS04 7H2O5,0-10,3

Na2Mo04 2H200,2-0,3

КI .0,52-0,90

FeS04-7H2025,0-30,6

Na2EDTA-2H2033,6-41,0

Тиамина гидрохлорид 0,15-0,25 Пиридоксина гидрохлорид0,40-0,60 Никотиновая кислота 0,40-0,60 Мезо-инозит80-120 Цистерна гидрохлорид 4-6 Сахароза 25000-30000 Агар 5800-6200 рН среды5,2-5,6 Ткань культивируют в колбах Эрленмейера емкостью 100 мл. содержащих 40 мл среды. Продолжу1тельность цикла выращивания ткани 30 дней, номер пассажа 33-й. При варианте культивирования в жидкой среде культуру выращивают в колбах Эрленмейера емкостью 500 мл на качалках со скоростью встряхивания 100 об/мин и амплитудой 25 мм. Каждая колба содержит 100 мл среды указанного состава без агара, цикл выращивания 2 недели.

Цитологические и кариологические характеристики штамма А..

Ткань представлявт собой гетерогенную популяцию, состоящую из трех групп клеток. Первая группа - клетки меристематического типа овальной формы среднего размера 64 х 74 мкм, содержание в культуре около 70%. Вторая группа представлена

клетками паренхимноготипа овальной формы, имеющих средние размеры 112 х 139 мкм, содержание в культуре около 25%. Третья группа - клетки паренхимного типа удлиненной формы среднего размера 64 х 440 мкм, содержание в культуре около 5%. Максимум митотической активности наблюдается на 8 и 14-й день культивирования.

Культура характеризуется анеупплоидией. увеличенным по сравнению с интактным растением количеством хромосом. Число хромосом%

2812

28-387

4222

44 - 5432

5618

Более 569

Культура не способна к морфогенезу. Получение препарата из биомассы штамма А2, обладающего кардиотропным действием. После окончания цикла культивированиЯ биомассу штамма А2 извлекают из культуральных сосудов и сушат в токе горячего воздуха (50 - 60°С) в течение суток. Готовят настойку в.соотношении 1 : 10 на 24%-ном этиловом спирте, используя метод перколяции в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи СССР X изДании. Для этого 100 г измель1 енного сырья смачивают в отдельном закрытом сосуде достаточным количеством зкстрагента. Через 4 ч набухший материал плотно укладывают в стеклянный перколятор и при открытом спускном кране Добавляют такое количество зкстрагента, чтобы слой его над поверхностью составил 2-3 мм. Вытекающую из крана жидкость наливают обрат :о в перколятор, закрывают кран и оставляют на 24 ч. Затем медленно перколируют, спуская за 1 ч объем жидкости, соответствующий примерно 1/43 используемого объема перколятора. Перколяцию ведут до получения 1 л настойки. Настойку отстаивают в течение 5 дней при 8°С. затем фильтруют.

Полученный препарат обладает профилактическим антиангинальным. антигипо ссическим, антиаритмическим и кардиопротекторным видами действия. П р и м е р. В колбы Эрленмейера обьег ом500 мл наливают по 100 мл питательной среды следующего состава, мг/л воды: NH4N03400

KN031900

КН2Р04170

CaCl2 6Н20665

MgSO-j- 7Н20370

НзВОз6,2

MnS04 4Н2022,3 CuS04 5H20 CoCl2 2H20 ZnS04 7H20 Na2Mo04 2H20 0,83 . Kl FeS04 7H20 Na2EDTA -2420 Тиамина гидрохлоридПиродоксинэ гидрохлоридНикотиновая кислотаМезо-инозит Цистеина гидрохлоридКазеина гидролизат 25000 5,6 Сахароза рН среды Колбы со средой стерилизуют при 117°С в течение 20 мин, затем в асептических условиях в каждую колбу помещают по 4 г клеточной биомассы штамма А2. Колбы устанавливают на качалку орбитного типа и встряхивают со скоростью 100 об/мин при амплитуде 25 мм. Культивирование проводят в темноте при 25°С и относительной влажности воздуха 70% в течение 14 сут. Затем биомассу отфильтровывают и взвешивают. В каждой колбе накапливается от 20 до 25 г сырой биомассы. Биомассу сушат при 55°С в токе горячего воздуха в течение суток, измельчают и затем готовят настойку 1:10 на 24%-ном этиловом спирте методом перколяции в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи СССР X изд. Далее сравнивают фармакологическое действие полученного препарата с действием настойки из стеблей (лианы) кирказона, полученной параллельно тем же способом. Во всех опытах настомки вводят лабораторным животным внутривенно в дозе 0,5 мл/кг веса. В контроле вводят соответствующее количество 24% этилового спирта. Оценка профилактического антиангинального действия. В опытах на бодрствующих кроликах самцах породы Шиншилла массой 2,5 - 3,0 кг изучают влияние настоек биомассы, штамма Аа и стеблей кирказона на порог возникновения ишемии миокарда, вызываемой сужением коронарной артерии, С этой целью за 2-3 сут до проведения эксперимента под нембуталовым наркозом проводят имплантацию -приспособления, позволяющего осуществить медленную окклюзию коронарной артерии с последующим восстановлением ее просвета. Порог ишемии миокарда определяют по степени сужения коронарной артерии, при которой появлялись признаки ишемии на прекардиальной злектрокардиоРрамме. Из данных, представленных в табл.1, видно, что настойка стеблей кирказона маньчжурского и настойка биомассы штамма А2 оказывают профилактическое антиангинальное действие во всех опытах, т.е. были эффективны в 100% случаев. По степени повышения порога ишемии миокарда обе настойки достоверно не отличаются друг от друга. Сравнительная оценка антиангинальной активности препаратов из стеблей и биомассы штамма Аг кирказона маньчжурского приведена в табл,1. Исследование антигипоксической активности. Изучают влияние препаратов из стеблей к/.рказона маньчжурского и биомассы штамма А2 на длительность сохранения биопотенциалов миокарда при острой асфиксии у мышей. С этой целью мышей массой 18-20 г наркотизировали этаминалом натрия (40 мг/кг внутрибрюшинно), выделяя трахею и подводили под нее лигатуру. Сразу после перевязки трахеи внутривенно вводят испытуемый препарат. Время сохранения биопотенциалов миокарда фиксируют, снимая ЭКГ во 11 стандартном отведении при визуальном контроле с помощью кардиоскопа. Из табл.2 видно, что препараты из стеблей и биомассы штамма А2 кирказона маньчжурского примерно в два раза увеличивают длительность сохранения биоэлектрической активности по сравнению с контролем, т.е. обладают выраженной антигипоксической активностью. Изучение антиаритмического и кардиопротекторного действия. Кардиопротекторное действие оценивают по влиянию препаратов на процесс формирования зоны некроза в остром периоде инфаркта миокарда у крыс, а также по течению ранних постокклюзионных аритмий. Опыты проводят на нелинейных крысах самцах массой 250-300 г, наркотизированных этаминалом натрия (40 мг/кг внутрибрюшинно), У животных, переведенных на управляемое дыхание, моделируют инфаркт миокарда перевязкой нисходящей ветви левой коронарной артерии на уровне нижнего края ушка предсердия. В течение первого часа после окклюзии коронарной артерии осуществляют визуальный контроль за состоянием сердечного ритма при помощи кардиоскопа, при необходимости записывая ЭКГ во И стандартном отведении. Размеры зоны некроза и зоны ишемии определяют через 4 ч после окклюзии коронарной артерии при помощи дифференциального индикаторного метода, После определения размеров зон повреждения рассчитывают процентное отношение зоны некроза к зоне ишемии в каждом опыте. Результаты представлены в табл.3. Препараты из стеблей биомассы штамма А2 кирказона маньчжурского обладают противоаритмичес а1м действием при ранних постокюиозмональных аритмиях. Настойка стеблей кирказоиа маньчжурского yMGHbiJjaeT частоту развития ранних постокклюпмонных аритмий с 72% (в контроле) до 33%, а настойка биомассы штамма А2 - до 27%, Под влиянием настоек увеличивается длительность латентного периода и одновременно примерно в 4 раза уменьшается продолжительность аритмии. Оба препарата существенно уменьшают размеры зоны некроза после воспроизведения инфаркта миокарда у крыс. Зоны некроза составля от соответственно 41 и 40% для настоек стеблей лианы и биомассы штамма А2 от зонь ишемии против 68% в контроле. Таким образом, препараты из стеблей лианы кирказона маньчжурского и из биомассы клеточного штамма А2 кирказона маньчуржского обладают профилактическим антиангинальным, антигипоксическим. противоаритмическнм и кардиопротекторным действием. Эффективность препарата из биомассы штамма А2 не уступает эффективности препарата из интактного растения. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования штамма А2 кирказона маньчжурского как источника препарата, обладающего кардиотропной активностью. Формула изобретения Штамм культивируемых клеток растений Aristolochia manshuriensis Кот. ВСКК(ВР) fsfe 37, используемый для получения препарата, обладающего кардиотропной активностью. Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности. Цель изобретения - получение активно растущего штамма клеток кирказона маньчжурского, обладающего кардиотропной активностью. Штамм Аг кирказона маньчжурского получен в результате генетической трансформации и селекции клеток кирказона. Штамм характеризуется высокой скоростью роста на безгормональных средах. Из биомассы штамма А2 получен препарат, обладающий профилактическим антиангинальным, антигупок- сическим, противоаритмическим и кардиопротекторным действием. Зтабл.

Условия

Контроль (физиологический раствор) Контроль (этанол, 24% р-р) Настойка стеблзй кирказона Настойка биомассы штаг- мз Да Различая с контролегй достовернь- при Р 0,05, в серии 10.

Таблица 2

Длительность сохранения биоэлектрйческой активности, мин

13,1 ±0,4

18,9 ±0,4

Различия с контролем достоверны Р 0,05. Количество животных в контрольной серии опытов 17, в опытных сериях 10-12.

10

1708836 Таблица 3

Продолжение табл.3