ШТАММ БАКТЕРИЙ STREPTOCOCCUS FAECIUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ БОРЬБЫ С ДИСБАКТЕРИОЗАМИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 C12N1/20 C12R1/46 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для борьбы с дисбактериозом сельскохозяйственных животных.

Известен штамм Streptococcus faecium (патент Австрии 383956 В, A 61 K 35/74 от 10.09.87 г.) и штамм Streptococcus faecium ВКПМ В-4054 (авторское свидетельство SU 1497211 A-1), используемый для приготовления бактериальных препаратов, имеющий длительный срок выращивания, требующий большую дозу посевного материала и имеющий низкую концентрацию активного начала в весовой дозе.

От известного штамма Streptococcus faecium ВКПМ-4054 (авторское свидетельство SU 1497211 A-1) предлагаемый отличается высокими технологическими свойствами (меньшим временем культивирования, более высокой продуктивностью, упрощенными питательными средами, высокой концентрацией активного начала в весовой дозе).

Целью изобретения является штамм, используемый для борьбы с дисбактериозами сельскохозяйственных животных, обладающий высокими технологическими свойствами, специфическим антагонизмом к ряду патогенов (синегнойной палочке, золотистому стафилококку, дизентерийной палочке Флекснера) и ферментативным потенциалом, способствующим усилению пищеварительных процессов в организме животных, усвоению питательных веществ корма и синтезу в желудочно-кишечном тракте витаминов группы "B" и молочной кислоты.

Штамм выделен из доминирующей микрофлоры желудочно-кишечного тракта здорового цыпленка методом накопительных сред. Штамм Streptococcus faecium M-3185 депонирован, коллекционный номер B-3490, коллекция ВНИИгенетики.

Морфологические и культуральные свойства
Клетки - грамположительные кокки размерами 0,9 мкм, располагаются парами, группами и короткими цепочками. Спор не образуют.

При выращивании штамма на агаризованной среде MRS (дрожжевой экстракт 0,5%; мясной экстракт 1,0%; пептон 1,0%; глюкоза 2%; лимоннокислый аммоний 0,2%; уксуснокислый натрий 0,5%; твин-80 0,1%; K₂HPO₄ 0,2%; MgSO₄ - 7H₂O 0,02%; MnSO₄ - 4H₂O 0,005%; агар 2%), а также среде, содержащей ферментолизат кукурузной муки (2% по PB), ферментолизат БВК (40 - 60 мг% по аминному азоту), агар 2% при pH 6,6 - 6,8, t = 38 ± 1^oC в течение 24 - 36 ч образуют выпуклые, беловатые, круглые, блестящие колонии с ровными краями диаметром 1 - 2 мм. В жидких средах того же состава образуют равномерную муть, оседающую на 3 - 4 день.

Физиолого-биохимические свойства штамма
Факультативный анаэроб, неподвижный, каталозоотрицательный, не содержит цитохромы дыхательного пути, не образует псевдокаталазу, индол, не восстанавливает нитраты в нитриты, не разжижает желатин, образует аммиак из аргинина, сквашивает и слабо пептонизирует молоко, накапливая 0,39% молочной кислоты на 14-е сутки, восстанавливают молоко с лакмусом и метиленовой синью, гидролизует эскулин, не гидролизует крахмал, растет в среде pH 9,6, 40% желчи, 6,5% NaCl, 4% таурохолата. Не образует газ из глюкозы, дает незначительное количество газа при росте на цитрате. Растет при 10^o и 45^oC, слабо при 50^oC. Образует слизь при росте в бульоне с сахарозой, выживает после прогрева при 63^oC в течение 30 минут, не восстанавливает 2,3,5 - трифенилтразолий хлорид.

Сбраживает маннозу, галактозу, арабинозу, трегалозу, мальтозу, глюкозу, лактозу, рибозу, салицин, мелибиозу, целлобиозу, амигдалин, фруктозу, декстрин, маннит, рамнозу. Не сбраживает сахарозу, раффинозу, мелецитозу, глицерин, дульцит, инулин, инозит, сорбит, сорбозу, ксилозу.

Для нормального роста штамма необходимы субстраты со сложными органическими формами азота (гидролизаты белков, смеси аминокислот), а также витаминами и факторами роста.

Оптимальное температурное плато роста 33 - 43^oC, растет при 45^oC и при 10^oC, выживает при прогревании в течение 30 минут при 65^oC. Оптимальное значение pH среды 6,6 - 6,8. Растет при pH 9,6.

Воздействию мутогенных факторов штамм не подвергался.

В составе препаратов Галлиферм (ТУ оп. 64-13-150-89) и Эниферм (ТУ оп. 19-21-03-91) штамм прошел тестирование на патогенность и антигенность в соответствии с требованиями к ветеринатным препаратам и допущен к применению в составе указанных пробиотиков (биологически активных кормовых добавок) для борьбы с дисбактериозами сельскохозяйственной птицы и пушного зверя соответственно.

Штамм выделен из доминирующей микрофлоры желудочно-кишечного тракта здорового цыпленка методом накопительных сред. Штамм выращивают на питательной среде МРС при температуре 37^oC в течение 18 - 48 часов. Штамм Streptococcus faecium M-3185 депонирован, коллекционный номер B-3490, коллекция ВНИИгенетики.

Штамм хранят на агаризованной среде в холодильнике при температуре 8 - 10^oC в течение 1 - 2 месяцев в виде лиофильно высушенной культуры в ампулах в течение 12 месяцев.

Биотехнологическая характеристика
Способ, условия и состав среды для размножения штамма
Штамм выращивают при температуре 37^oC в течение 18 - 48 часов в жидкой или агаризованной среде МРС следующего состава:
пептон - 10 г/л
мясная вода - 100 мл/л
дрожжевой автолизат - 50 мл/л
глюкоза - 20 мл/л
твин - 80 - 1 мл/л
K₂HPO₄ - 2 г/л
уксуснокислый натрий - 5 г/л
лимоннокислый аммоний - 2 г/л
магний сернокислый - 2 г/л
марганец сернокислый - 0,05 г/л
вода дистиллированная - до 1 литра
pH - 6,6 - 6,8
Возможно также использование агаризованной среды следующего состава:
ферментолизат дрожжей БАК - 2,0% по аминному азоту
ферментолизат кукурузной муки - 2,0% по PB
кукурузный экстракт - 0,3%
агар-агар - 2,0%
вода водопроводная - до 100%
pH - 6,6 - 6,8
Стерилизация среды при температуре 118 - 122^oC в течение 30 минут.

Условия и состав среды для ферментации
Выращивание ведут при температуре 33 - 43^oC в течение 18 часов на среде следующего состава:
ферментолизат дрожжей БВК - 2,0% по аминному азоту
ферментолизат кукурузной муки - 2,0% по PB
кукурузный экстракт - 0,3%
вода водопроводная - до 100%
pH - 6,6 - 6,8
Стерилизация среды при 118 - 112^oC в течение 30 минут. Посевная доза 0,5 - 1%.

По окончании процесса ферментации культуральную жидкость сепарируют при комнатной температуре. Пасту высушивают на распылительной сушилке (t входа = 120^oC, t выхода = 54 - 58^oC).

Активность штамма и способ ее определения
Штамм накапливает 0,34% молочной кислоты при культивировании на молоке. Удельная скорость роста на бульоне МРС достигает 1 ч^-1. Активность штамма определяют разбавлением 5 мл культуральной жидкости в 10 мл дистиллированной воды и титрированием 0,1 н. NaOH в присутствии индикатора - фенолфталеина.

Штамм осуществляет гомоферментативное молочнокислое брожение, обладает высокой удельной скоростью роста, специфическим антагонизмом к Klebsiella pnevmonia, Mycobacterium smegmatis, Nocardia asteroides, а также к синегнойной палочке, золотистому стафилококку, дизентерийной палочке Флекснера.

Штамм Streptococcus faecium M-3185 рекомендуется для применения в ассоциативной композиции со штаммами Lactobacillus species, Lactobacillus case, lactobacillus acidophilus в качестве компонента, обладающего специфическим антагонизмом к ряду патогенов (синегнойной папочке, золотистому стафилококку, дизентерийной палочке Флекснера) и ферментативным потенциалом, способствующим усилению пищеварительных процессов в организме животных и усвоению питательных веществ корма и синтезу в желудочно-кишечном тракте витаминов группы "B" и молочной кислоты.

Пример. Полученную, как описано в биотехнологической характеристике, сухую биомассу штамма Streptococcus faecium M-3185 смешивают с сухой биомассой штаммов бактерий Lactobacillis species M-76AT (ВКПМ 4488), Lactobacillus case МБ (ВКПМ 4486), полученной аналогично, в пропорции 1 : 1 : 1 по количеству жизнеспособных клеток. Полученный таким образом препарат (Галлиферм) используют в качестве биологически активной кормовой добавки (пробиотика) для сельскохозяйственной птицы.

Использование: микробиологическая промышленность, пробиотик для борьбы с дисбактериозами сельскохозяйственных животных. Сущность изобретения: предложен штамм бактерий Streptococcus faecium М-3185 (коллекция ВКПМ В-3490), используемый для борьбы с дисбактериозами сельскохозяйственных животных. Культура выделена из доминирующей микрофлоры желудочно-кишечного тракта здорового цыпленка методом накопительных сред. Штамм выращивают на питательной среде МРС при 37^oC в течение 18-48 ч. Штамм осуществляет гомоферментативное молочнокислое брожение, обладает высокой удельной скоростью роста, специфическим антагонизмом к Klebsiella pnevmonia, Mycobacterium smegmatis, Nocardia asteroides, а также к синегнойной палочке, золотистому стафилококку, дизентерийной палочке Флекснера.

Штамм бактерий Streptococcus faecium М-3185 (коллекция ВКПМ NВ-3490), используемый для борьбы с дисбактериозами сельскохозяйственных животных.