Штамм 85-продуцент -аспарагиновой кислоты Советский патент 1979 года по МПК C12K1/02 C12D13/06 

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма, продуцирующего L-аспарагиновую кислоту.

Одним из методов получения аспарагиновой кислоты является использование бактериального фермента - аспартазы, либо целых клеток бактерий, содержащих тот же фермент.

Известен штамм бактерий Escherichia соИ АТСС 11303, продуцирующий аспарагиновую кислоту .

Этот штамм инкубируют глубинным способом на среде, содержащей в 1 л: 30 г фумарата аммония, 2 г К2НРО4, 0,5 г MgSO47Н20, 0,5 г СаСОз и 40 г кукурузного экстракта (рН среды 7,0) в течение 24 час при 37°С.

Об аспартазной активности целых бактериальных клеток, предварительно отделенHbix от среды, судят общепринятым способом по образованию аспарагиновой кислоты из фумарата аммония биологическим методом с использованием Leuconostoc шеsenteroides Р-60 и спектрофотометрически по потреблению фумарата. Ферментативную активность выражают в микромолях (мкМ) аспарагиновой кислоты, синтезированной за 1 час целыми клетками бактерий. Удельная аспартазная активность нативных

клеток Е. coli АТСС 11303 при росте на указанной среде составляла 1,81 мкМ аспарагиновой кислоты за 1 час на 1 мг белка.

Недостатками известного штамма являются:

1)сравнительно длительный цикл развития штамма (24 час), что ведет к повышению стоимости целевого продукта;

2)штамм развивается на среде с кукурузным экстрактом, что связано со сложностями отделения бактериальных клеток от осадка экстракта и увеличивает стоимость целевого продукта;

3)сравнительно низкая аспартазная активность на указанной среде - 1,81 мкМ аспарагиновой кислоты на 1 мг белка за 1 час.

Цель изобретения - получение нового штамма бактерий того же рода, синтезирующего на разных средах высокоактивный внутриклеточный фермент-аспартазу, отвечающего требованиям, предъявляемым к продуценту и обладающего коротким циклом выращивания (6 час), большим выходом целевого продукта, получаемого в виде чистого оптического изомера (L-форма аспарагиновой кислоты, «ID +25,5°), т. е. штамма, не обладающего рацемазной активностью.

Предлагаемый штамм выбран из числа чистых культур микроорганизмов, выделенных из различных природных субстратов (почвы, воды) на мясо-пептонной агаризованной среде (МПА) с 0,5% лактозы и фуксином.

Штамм хранится в коллекции чистых культур микроорганизмов кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ за № 85.

Штамм имеет следуюндие морфологические и физиологические признаки.

Клетки бактерий представляют собой грамотрицательные подвижные палочки с закругленными концами 0,5-1X3 пм, капсул и спор не образуют. Факультативные анаэробы. Оптимальный рост наблюдается при температуре 30-37°С. Колонии на мясо-пептонном агаре (МПА) - блестящие, беловатые, мелкозернистые, однотипные, диаметром 2-3 мм. Рост на мясо-пептоннбм бульоне (МПБ) обильный с сероватым оттенком, пленки не образуется. В 24-часовых культурах 1наблюдается образование индола. При pOifeHa молоке образует кислртьги газ . Хорощо растет на картофельной среде в, виде серовато-желтого налета. Культураобладает характерным фекальйьшзапахом.

Биохимические признаки. Отношение к углеводам: разлагает с образованием кисШтамм

Е. coli штамм 85 (предложенный) Е. соИ АТСС 11303 (известный)

лоты и газа, но не сероводорода, глюкозу, фруктозу, лактозу, галактозу, мальтозу, арабинозу, ксилозу. Проба с метиловым красным положительная. Ацетоин не образует. Отношение к другим органическим соединениям: использует в качестве источника углерода пируват, формиат, фумарат, глицерин. Не растет на средах, содержаш,их в качестве единственного источника углерода

лимонную кислоту и ее соли. Отношение к азотистым веществам: хорошо растет за счет аммонийного азота, пептона, урацила. Азот мочевой кислоты не использует. Питраты восстанавливает до нитритов. Обладает каталазной активностью.

При сравнении с известным штаммом Е. соИ АТСС 11303 путем определения общепринятым методом аспартазной активности при инкубации суспензии целых клеток

бактерий с фумаратом аммония в течение 1 час, предлагаемый штамм образует много большее количество аспарагиновой кислоты. Интенсивность развития и аспартазная

активность у предлагаемого штамма выше, чем у известного.

Количество аспарагиновой кислоты, образованной из фумарата аммония суспензиями целых клеток предлагаемого и известного

штаммов, выросших на среде с кукурузным экстрактом, видна из приведенной таблицы.

Удельная активность аспартазы

(мкМ аспарагиновой кислоты

на 1 мг белка за 1 час)

Среда

МПБ

с кукурузным экстрактом

12,01-35,f

15,4-46,0 1,81 Нет данных

Как видно из таблицы, предлагаемый штамм Е. coli 85 отличается от известного штамма Е. coli АТСС 11303 высокой аспартазной активностью.

Для получения настоящего штамма исследован ряд проб воды и образцы почв СССР. Штамм выделен из ночвы удобренного садового участка (станция Зеленоградская Ярославской железной дороги Московской области).

Пример 1.. Односуточные клетки Е. coli штамм 85 смывают с поверхности мясо-пептонного агара (МПА - общеизвестная стандартная среда) 1-2 мл жидкой стерильной среды и с помощью стерильной пипетки переносят в посевную жидкую стерильную среду следующего состава (на 1 л): фумарат аммония 30 г, К2НРО4 2 г, MgSOi-TnaO 0,5 г, СаСОз 0,5 г, кукурузный экстракт 40 г. Культуру выращивают 10-12 час глубинным способом при температуре 30-35°С в качалочных колбах емкостью 750 мл (объем среды 50 мл). Затем посевной материал в количестве 2-3% вносят в стерильную среду того же состава и выращивают тем же способом в течение 6 час в аналогичных качалочных колбах с объемом среды 125 мл. По истечении указанного времени целые клетки Е. coli штамм 85 обладают аспартазной активностью, равной 12,01-35,88 мкМ аспарагиновой кислоты на 1 мг белка за 1 час.

Клетки отделяют от среды с помощью проточной центрифуги С-44, промывают 3- 4 раза 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,5) и определяют активность аспартазы известным методом инкубации суспензии целых клеток бактерий с фумаратом аммоНйя. Удельная аспартазная активность целых клеток Е. соИ штамм 85 составляет от 12,01 до 35,88 мкМ аспарагиновой кислоты, образованной 1 мг белка за 1 час.

Пример 2. Односуточные клетки Е. coli штамм 85, выросшие на МПА, суспендируют в мл стерильной жидкой питательной среды, переносят стерильной пипеткой в жидкую посевную среду того же состава (мяср-нептонный бульон - МПБ), культивируют глубинным способом при рН 7,0 в течение 10-12 час при 30- 35°С в качалочных колбах емкостью 750 мл (объем среды 50 мл). Затем посевной материал в количестве 2-3% вносят в среду того же состава и выращивают бактерии в течение 6 час тем же способом в аналогичных качалочных колбах с объемом среды 125 мл. По истечении указанного времени аспартазная активность целых клеток Е. соИ штамм 85 составляет в разных опытах от 15,4 до 46,0 мкМ аспарагиновой кислоты на 1 мг белка за 1 час.

Клетки отделяют от среды культивирования с помош,ью центрифугирования на проточной центрифуге С-44. Биомассу промывают 1-2 раза 0,01М фосфатным буфером рН 7,5 и определяют активность аспартазы общепринятым методом по количеству образованной аспарагиновой кислоты из фумарата аммония суспензией целых клеток бактерий. Удельная активность аспартазы 6-часовых целых клеток Е. coli штамм 85, выросших на мясо-пептонном бульоне, составляет от 15,4 до 46,0 мкМ аспарагиновой кислоты на 1 мг белка за 1 час.

Предлагаемый штамм по сравнению с известными штаммами имеет следующие преимущества: короткий период выращивания (6 час); хороший рост штамма на МПБ; высокий выход целевого продукта; образование целевого продукта в виде чистого оптического L-изомера аспарагиновой кислоты а D° +25,5°, т. е. отсутствие рацемазной активности.

Формула изобретения

Штамм Escherichia coli 85 - продуцент L-аспарагиновой кислоты. Хранится в коллекции чистых культур кафедры микробиологии биологического факультета МГУ.

Морфологические признаки. Клетки - грамотрицательные подвижные палочки с закругленными концами размером 0,5-1X3 нм, капсул и спор не образуют.

Физиологические признаки. Мясо-пептонная агаровая среда. Рост хороший, колонии блестящие, беловатые, мелкозернистые, однотипные, диаметром 2- 3 мм. При добавлении к среде фуксина колонии приобретают характерный металлический блеск. Обладает фекальным запахом. Мясо-пептонный бульон. Рост обильный. Клетки с сероватым оттенком, пленок не образуют. Среда не окрашена. Образует индол.

Молоко, при росте на молоке образует кислоты и газ.

Картофельная среда. Рост хороший. Колонии серовато-желтого цвета. Биохимические признаки. Отношение к углеводам: разлагает с образованием кислоты и газа глюкозу, фруктозу, лактозу, галактозу, мальтозу, арабинозу, ксилозу.

Отношение к источникам углерода. Использует пируват, формиат, фумарат, глицерин.

Не растет на лимонной кислоте и ее солях.

Проба с метиловым красным положительная. Ацетоин не образует.

Отношение к источникам азота. Усваивает соли аммония, пептон, урацил. Нитраты восстанавливает до нитритов.

На мочевой кислоте рост отсутствует. Факультативный анаэроб. Оптимальный рост наблюдается при 30-37°С. Выход аспарагиновой кислоты из фумарата аммония суспензиями 6-часовых целых клеток бактерий, выросших на среде с кукурузным экстрактом, составляет 12,01-35,88 мкМ/мг белка/час, на МПБ - 15,4-46,0 мкМ/мг белка/час.

Продукт обладает высокой степенью оптической чистоты, является L-изомером аспарагиновой кислоты сс +25,5°.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент Франции 2158300, кл. С 12D 13/00, 1973.