Способ определения нейровирусов в спинномозговой жидкости Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 C12Q1/06 

Изобретение относится к медицине.

Целью изобретения является повы- .шение чувствительности способа

Способ осуществляют следующим образом.

Дпя обнаружения вируса использовались первичные культуры нейронов спинного и головного мозга эмбрионов (12-14- и 16-18-суточные, соответственно) крыс, приготовленные следующим образом. Беременные крысы соответствующих сроков беремнности помещались в атмосферу углекислого газа-; наркотизировались и забивались переломом шеИд После извлечения эмбрионов их помещали в раствор Хэнкса, отмывали в нем, затем у эмбрионов вскрывали спинно-мозговой канал или

черепную коробку, извлекали спинной или головной мозг. Мозг очищали от оболочек, измельченная мозговая ткань многократно пипетировалась пастеровскими пипетками различных диаметров (от большего к меньшему). В течение 5 мин пробирка со взвесью клеток отстаивалась для осаждения на дно крупных кусочков ткани, супернатант собирался и наносился нл покровные стекла, предварительно покрытые коллагеном. Затем культуры помещались в термостат при 37°С. Культивирование вели в чашках Петри.

Исследование спинно-мочговой жидкости (СМЖ ) на культуре клеток проводили следующим обраги м„

СП

to

;о

Ко

В 10-14-суточных культурах клеток ростовая среда изымалась и вносилась минимальная среда Игла МЕМ с добавлением глюкозы до 600 мг/% (рН 6,0-6,5)на 1 ч. Затем культуры переносили в ростовую среду (МЕМ 80% j сыворотка плацентарной крови человека 10%; лошадиная сыворотка 10%, глюкоза 600 мг/% ) и добавляли к ней 10% СМЖ. Через 1-5 суто стекла с культурами извлекали из среды роста, промывали 5 мин в физиологическом растворе, .подсушивали феном и фик- . сировали в охлйжденном до +А°С аде- тона 7 Мин. После фиксации стекла отмывали 2 раза по 3 мин в физиологическом растворе и погружали на 10 мин (клетками вверх) в раствор азида натрия (0,001 М) с добавлением 0,01% перекиси водорода о Затем стекла с клетками отмывали 3 раза по 10 мин и подсушивали феном. На культуры клеток наносили необходимые кроличьи антисыворотки (к вирусу простого герпеса или приону амиотрофического лейко- спонгиоза) в рабочем разведении 1:50 и помещали во влажную камеру на 40 мин при 37 С. Затем клетки снова отмывали, и наносили коньюгат овечьи антикроличьи антитела меченные перок- сидазой) в разведении 1:100, Через 40 мин контакта во влажной камере при 37°С повторяли процедуру отмывки, и стекла с исследуемыми культурами клеток погружали в темной камере в раствор субстрата (35 мг 3,3-диа минобензидина в 50 мл физиологического раствора и 0,03% перекиси водорода на 30 миНо Затем стекла изв- лекали, отмывали, проводили через серию спиртов и ксилол, и заключали в канадский бальзам. Результат учитывали под световым микроскопом, по наличию в зараженных клетках корич нево окрашенных круглых структур, при отсутствии таковых в незараженныХ клетках.

Дпя того, чтобы установить опти-, мальные условия для проникновения возбудителей из СМЖ в клетки был проделан ряд опытов. Культура клеток нейронов обрабатывалась средой с рН 6,0-6,5 в течение 30-60 мин. Это было сделано для изменения проницаемости клеточной мембраны.

Пример 1. Исследовали СМЖ больной К, с подозрением на герпетический энцефалит. Заражали эмбриональную культуру клеток диссоциированных нейронов после обработки ее средой с рН 6,0 в течение 30 мин Через 2 сут после заражения в нейронах были выявлены антигены вируса простого герпеса иммунопероксидаз- ным методом. Диагноз - герпетический энцефалит

П р и м е р 2. Исследование СМЖ больной Д с подозрением на амиотро- фический лейкоспонгиоз, заражали культуру клеток диссоциированных нейронов после обработки их в тече-. ние 40 мин средой с рН 6,0. Через 3 сут после культивирования в клетках бьш обнаружен антиген возбудителя о Диагноз - амиотрофический лейкоспонгиоз о

П р и м е р 3. СМ}К больной Г. с подозрением на амиотрофический лейкоспонгиоз заразили эмбриональную культуру клеток диссоциированных нейронов после их предварительной обработки средой с рН 6,5 в течение 15 мин. При наблюдении и исследовании этой культуры в течение 2 недель развития вирусной инфекции не установлено.

Предварительная обработка культур клеток диссоциированных нейронов приводит к повыгаению чувствительности метода - из 53 образцов СМЖ с подозрением на герпетическую инфекцию при использовании предлагаемого способа вирус выявлен в 23 случаях, а по способу-прототипу - в 11 случаяХо

Формула изобретения

Способ определения нейровирусов в спинно-мозговой жидкости, включаю- пщй культивирование вирусов в культуре клеток с последующим иммунофер- ментным анализом, отличающий с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве культуры клеток используют первичные диссоциированные нейроны мозга 3M6prf- онов, которые перед определением нейровирусов обрабатывают минимальной средой Игла с рП 6,0-6,5 в течение 30-60 мин.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике нейроинфекций. Цель - повышение чувствительности способа. Для обнаружения нейровирусов в спинномозговой жидкости используют первичные культуры нейронов спинного и головного мозга эмбрионов крыс, предварительно обработав их средой Игла с PH 6,0-6,5 в течение 30-60 мин. После инкубации в нейронах выявляют антигены вируса иммунопироксидазным методом. Предварительная обработка культур клеток приводит к повышению чувствительности способа на 20%.