Способ подготовки пробы для выделения вируса бешенства белых мышей в реальном времени Российский патент 2025 года по МПК G01N33/48 C12N7/00 C12N7/02 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, иммунологии, в частности к способу подготовки пробы для выделения вируса бешенства.

Известно техническое решение, включающее получение суспензий из мозга белых мышей, экспериментально зараженных вирусом бешенства, дезинтеграцию на приборе Fast Prep-24™ при скорости вибрации 6 мл/с в присутствии однородных частиц карбида кремния, центрифугирование полученной надосадочной жидкости для удаления посторонних частиц, ультрацентрифугирование для осаждения вирусных частиц и отделение вируса бешенства в ступенчатом градиенте сахарозы, отличающийся тем, что перед дезинтеграцией мозговую ткань дополнительно гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе не менее 3-5 мин, в 0,1 М фосфатно-буферном растворе, рН 7,2-7,4, а дезинтеграцию проводят три раза в течение 30 с с интервалом между обработками 5 мин, затем полученную мозговую суспензию выдерживают в пробирках Blue Lysing Matrix В не менее 5 мин до полного осаждения шариков карбида кремния, супернатант отбирают в отдельную емкость, а в пробирки добавляют 0,1 М фосфатно-буферного раствора, рН 7,2-7,4, встряхивают 3 раза на Vortex V1 в течение 30 с и выдерживают не менее 5 мин, полученный супернатант отбирают и все полученные супернатанты объединяют, а центрифугирование проводят в течение 50 мин при 5000 об/мин, супернатант отбирают в стерильную емкость и концентрируют ультрацентрифугированием при 37000 об/мин в течение 4 часов при температуре +4°С, супернатант удаляют, а к осадку добавляют 0,1 М фосфатно-буферного раствора рН 7,2-7,4 в объеме, равном 1/10 от объема исходного элюата, три раза встряхивают в течение 30 с. с интервалами между встряхиваниями 3 мин, затем ресуспендированный осадок наслаивают на ступенчатый градиент 10-60%-ной сахарозы и ультрацентрифугируют в течение 3 часов при 30000 об/мин при температуре+4°С (Патент РФ №2694836, кл. A61K 39/205 А61Р 31/12, G01N 33/53, 2019 г.).

Также известен метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1), включающий отбор тканей из головного мозга белых мышей, их измельчение до размеров 0,5-1,0 см, центрифугирование в течение 5-10 мин при скорости 2000 об/мин, использование антибиотиков: пенициллина и стрептомицина по 100 ЕД/см³ и 1 мг/см³ соответственно и 25% раствора трипсина, внесение суточной культуры в ростовую среду с 10%-ной эмбриональной сывороткой крови крупного рогатого скота и 3%-ным глютамином до концентрации 2×10⁵ клеток/см³ в лунки культурального стекла и помещение их во влажный CO₂-инкубатор с содержанием CO₂ 5% при температуре (37±1)°С на 18-20 ч с последующим проведением исследований для выделения вируса бешенства белых мышей (ГОСТ 26075-2013, Методы лабораторной диагностики бешенства, раздел 8, стр. 5, https://files.stroyinf.m/Data2/1/4293777/4293777838.pdf - прототип).

Недостатком стандартного способа диагностики является длительный процесс подготовки пробы, которая включает гомогенизацию отобранных тканей из головного мозга белых мышей, их измельчение до размеров 0,5-1,0 см с постепенным добавлением стерильного 0,9%-ного изотонического раствора натрия хлорида до получения 10%-ной суспензии. Такая процедура подготовки пробы требует затраты времени, использование дополнительных материалов и повышает риск контаминации, что влияет на точность диагностики.

Техническим результатом является получение достоверной информации при диагностике в реальном времени за счет снижения риска контаминации.

Технический результат достигается тем, что в способе подготовки пробы для выделения вируса бешенства белых мышей, включающем отбор тканей из головного мозга белых мышей после их усыпления, измельчение тканей до размеров 0,5-1,0 см, центрифугирование в течение 5-10 мин при скорости 2000 об/мин, внесение суточной культуры в ростовую среду с 10%-ной эмбриональной сывороткой крови крупного рогатого скота и 3%-ным глютамином до концентрации 2×10⁵ клеток/см³, внесение получившейся суспензии в лунки культурального стекла и помещение их во влажный CO₂-инкубатор с содержанием CO₂ 5% при температуре 36-38°С на 18-20 ч, отличающийся тем, что отобранные ткани после измельчения обрабатывают 0,25% раствором трипсина в течение 10 мин при температуре 37°C, а в качестве ростовой среды используют среду ИГЛА-MEM, в которую добавляют буферный агент HEPES в количестве не более 1% от массы ростовой среды и антибиотики пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/см³ и 1 мг/см³, соответственно.

Новизна заявляемого способа обработки пробы из тканей мозга белых мышей с целью выделения вируса бешенства в реальном времени заключается в том, что сразу после усыпления животного отобранные ткани его мозга подвергаются обработке с использованием при определенных условиях 25% раствора трипсина, протеолитического фермента, который расщепляет белки, для диссоциации прилипших клеток от сосуда, в котором они культивируются в ростовой среде ИГЛА-MEM с добавлением буферного агента HEPES в количестве не более 1% от массы ростовой среды и антибиотиков.

Ростовая среда Игла MEM имеет двойной набор аминокислот и витаминов (ДМЕМ), рН 7,2 (ЕС Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products for Human and Veterinary Use) и является наиболее распространенной средой для культивирования клеток наряду со средой DMEM. Среда MEM содержит 13 аминокислот, 6 водорастворимых витаминов, холин и инозит, выполняющие роль углеводородного субстрата (http://old.rosmedbio.ru/Docs/BT/prodact/instruczii/mem.jpg).

Ростовая среда MEM содержит следующие компоненты, представленные в таблице.

Буферный агент HEPES HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансулъфоновая кислота) представляет собой цвиттерионный органический буферный агент; один из двадцати в списке буферных растворов Гуда. HEPES широко используется в работах, связанными с клеточными культурами, главным образом потому, что лучше поддерживает физиологический рН, несмотря на изменения концентрации диоксида углерода (вырабатывающемся при клеточном дыхании) по сравнению с бикарбонатными буферами, которые также широко используются в данной сфере. При уменьшении температуры диссоциация воды уменьшается, а константы диссоциации (pK) многих буферов при этом существенно не меняются. У HEPESa подобно воде уменьшается диссоциация при понижении температуры. Это делает HEPES более эффективным буферным агентом для поддержания структуры и функции ферментов при низких температурах.^[1] Однако, в публикации Лепе-Зунига и соавт. сообщалось о фототоксичности HEPES, когда под воздействием света образуется перекись водорода^[2][3], чего не происходит в бикарбонатных клеточных буферах. Поэтому настоятельно рекомендуется как можно меньше подвергать раствор воздействию света. HEPES имеет следующие характеристики: pKa₁ (25°С)=3; pKa₂ (25°С)=7.5. Полезные диапазоны рН: от 2,5 до 3,5 или от 6.8 до 8.2 (https://ru.wikipedia.org/wiki/HEPES).

Способ подготовки пробы для выделения вируса бешенства белых мышей в реальном времени осуществляют следующим образом

Для исследования используют здоровых живых белых мышей. Их усыпляют, вскрывают черепную коробку и отбирают ткани из головного мозга белых мышей, измельчают их до размеров 0,5-1,0 см и сразу обрабатывают 25% раствором трипсина в течение 10 мин при температуре 37°С. Затем центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об/мин. Отбирают надосадочную жидкость вносят ее в стерильный флакон и держат при 4°С до применения. Суточную культуру вносят в ростовую среду в качестве которой используют среду ИГЛА-MEM, в которую добавляют буферный агент HEPES в количестве не более 1% от массы ростовой среды и антибиотики: пенициллина и стрептомицина по 100 ЕД/см³ и 1 мг/см³ соответственно, а также добавляют 10%-ную эмбриональную сыворотку крови крупного рогатого скота и 3%-ный глютамин с концентрацией 2×10⁵ клеток/см³ в лунки культурального стекла, которые помещают во влажный CO₂-инкубатор с содержанием CO₂ 5% при температуре (37±1)°С на 18-20 часов с последующим проведением исследований для выделения вируса бешенства белых мышей. Влажный CO₂-инкубатор необходим для дозирования и регулирования таких физических параметров, как влажность, температура, содержание CO₂ в вентилируемом воздухе. Система оснащена датчиками содержания газов (CO₂ и O₂), температуры, влажности, причем измерения осуществляются со строгой периодичностью. Погрешность регулирования концентрации CO₂ достигает 0,1% - это очень малая величина в общем объеме газовой смеси. Большинство инкубаторов поддерживают диапазон значений концентрации углекислого газа 0-20%), кислорода - 0,2-95%. Большинство клеточных культур теплокровных животных и человека культивируются при условиях содержания в атмосфере 5% CO₂, 70% влажности и температуре 37°С.

Пример конкретного осуществления Выделение глиальной культуры клеток белых мышей и ее первичную трипсинизацию (обработка 25% раствором трипсина) осуществляют после усыпления и вскрытия черепной коробки у белых мышей для извлечения головного мозга. Ножницами мелко его нарезают и вносят в раствор трипсина (0,25%) на 10 минут при 37°С. Для осаждения клеток проводят центрифугирование. Полученные клетки отмываем в среде Игла MEM трижды. Пипетирование проводят в ростовой среде - среда Игла MEM, в которую добавляют 3% глютамин, 10% сыворотку эмбрионов телят, 1% HEPES и антибиотики.

Полученную суспензию клеток вносят в лунки стекол для культивирования по 0,1 см, закрывают крышкой и помещают во влажный CO₂-инкубатор. Содержание углекислого газа должно быть 5%, а температура 37±1°С.

Время экспозиции составляет 18-20 ч.

Приготовленную суспензию из патматериала вносят в объеме 0,05 см³ в лунки стекла Две лунки оставляют для «+» и «-» контроля. Для контроля «+» применяют патматериал (мозг мыши со штаммом CVS). Штамм CVS фиксированного вируса бешенства БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020, Т. 20, №2 107 BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2020, V. 20, No. 2. Молекулярно-генетическое исследование стабильности и подтверждение подлинности штамма Внуково-32, применяемого для производства вакцины антирабической культуральной концентрированной очищенной инактивированной сухой.

Для контроля «-» используют материал от здоровой мыши. Культуральные стекла закрывают крышкой и помещают во влажный CO₂-инкубатор. Время экспозиции составляет 42-48 ч. Содержание углекислого газа должно быть 5%, а температура 37±1°С.

После выдержки из лунок откачивают среду. Клетки моют один раз, внося 0,2 см³ фосфатно-буферный раствор (ФБР) молярной концентрации 0,01 моль/дм, рН 7,2-7,4. В течение 20-30 мин. В воздушном ламинарном потоке подсушивают. После подсушивания в лунки для фиксации заливают по 0,1 см³ ацетона (-20°С) ацетона со временем экспозиция 30 мин.

Стекла после экспозиции для удаления ацетона переворачивают и встряхивают. В течение 20-30 мин подсушивают в воздушном ламинарном потоке. В течение 5-10 мин. еще раз высушивают после удаления пластиковых насадок. В лунки вносят - флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин (ФАГ); (объем 0,05-0,10 см³). Экспозиция во влажной чашке Петри составляет 30 мин, а температура 37±1°С. После экспозиции трижды промывают с 10 минутным ожиданием нахождения стекол в растворе ФБР. Ополаскивают дистиллированной водой. Затем в течение 20-30 минут высушивают на воздухе.

На приготовленные препараты для просмотра в люминисцентном микроскопе вносят каплю масла (иммерсионное, нефлуоресцирующее). На люминесцентном микроскопе просматривают приготовленные препараты.

При отрицательном контроле - препараты, не пораженные возбудителем рабической инфекции культура клетки тусклая, серовато-желтая. При положительном контроле - на препаратах видно, что в цитоплазме культур клеток имеется антиген в форме желто-зеленых гранул.

Диагноз устанавливают при выявлении указанных вышеуказанных гранул в исследуемых препаратах. Отрицательный диагноз ставиться, когда антиген рабического вируса не выявлен.

Результаты окончательные и исследования другими методами не проводят. Данный способ позволяет использовать свежеприготовленные первично-трипсинизированные глиальные культуры клеток из головного мозга белых мышей, в случаях когда нет банка культур клеток.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Описан способ подготовки пробы для выделения вируса бешенства белых мышей, включающий отбор тканей из головного мозга белых мышей после их усыпления. Следом идёт измельчение тканей до размеров 0,5-1,0 см, центрифугирование в течение 5-10 мин при скорости 2000 об/мин, внесение суточной культуры в ростовую среду с 10%-ной эмбриональной сывороткой крови крупного рогатого скота и 3%-ным глютамином до концентрации 2×10⁵ клеток/см³. Затем идёт внесение получившейся суспензии в лунки культурального стекла и помещение их во влажный CO₂-инкубатор с содержанием CO₂ 5% при температуре 36-38°С на 18-20 ч. Способ отличается тем, что отобранные ткани после измельчения обрабатывают 0,25%-ным раствором трипсина в течение 10 мин при температуре 37°C, а в качестве ростовой среды используют среду ИГЛА-MEM, в которую добавляют буферный агент HEPES в количестве не более 1% от массы ростовой среды и антибиотики пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/см³ и 1 мг/см³, соответственно. Техническим результатом является получение достоверной информации при диагностике в реальном времени за счет снижения риска контаминации. 1 табл., 1 пр.

Способ подготовки пробы для выделения вируса бешенства белых мышей, включающий отбор тканей из головного мозга белых мышей после их усыпления, измельчение тканей до размеров 0,5-1,0 см, центрифугирование в течение 5-10 мин при скорости 2000 об/мин, внесение суточной культуры в ростовую среду с 10%-ной эмбриональной сывороткой крови крупного рогатого скота и 3%-ным глютамином до концентрации 2×10⁵ клеток/см³, внесение получившейся суспензии в лунки культурального стекла и помещение их во влажный CO₂-инкубатор с содержанием CO₂ 5% при температуре 36-38°С на 18-20 ч, отличающийся тем, что отобранные ткани после измельчения обрабатывают 0,25%-ным раствором трипсина в течение 10 мин при температуре 37°C, а в качестве ростовой среды используют среду ИГЛА-MEM, в которую добавляют буферный агент HEPES в количестве не более 1% от массы ростовой среды и антибиотики пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/см³ и 1 мг/см³, соответственно.