ШТАММ ВИРУСА КРАСНУХИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (МИБП) Российский патент 2013 года по МПК C12N7/00 A61K39/20 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и может быть использовано при получении моновакцины против краснухи и ассоциированных вакцин, содержащих краснушный компонент, а также для получения диагностических препаратов.

В настоящее время наиболее известен вакцинный штамм вируса краснухи Wistar RA27/3 S.Plotkin), который используется как для получения вакцин, так и для разработки диагностических препаратов. Установлено, что вакцины из штамма Wistar RA27/3 вызывают 40% артралгий у взрослых (Banatlava J.E., Brown D.W. Rubella/Lancet, 2004, v.3663 p.1127-1137). Установлено также, что штамм Wistar RA27/3 относится к вирусам краснухи 1-ой генетической линии, тогда как для территории РФ, по данным ВОЗ, эндемичными считаются штаммы 2-ой генетической линии, а именно генотип 2С (World Health Organization. Global distribution of measles and rubella genotypes-update/VWkly. Epidemiol. Rec. - 2006. - V.81(51/52). - P.474-479)

Известен также штамм вируса краснухи «Орлов-Д» и способ получения вакцины против краснухи на диплоидной линии клеток «М-22» (патент №2173344, приоритет от 28.06.1999 г.) Однако, штамм «Орлов-Д», адаптирован к фибробластам эмбриона человека. Полученные на его основе диагностические препараты высокой чувствительности (антигены для иммуноферментного и иммунофлуоресцентного анализа) могут вызывать ложно-положительные реакции из-за наличия в конечном продукте антигенов человеческого происхождения

Наиболее близким к заявляемому является вакцинный штамм вируса краснухи "Орлов-В» (патент РФ №2081912, приоритет 22 мая 1995 г.). Штамм получен путем многократного пассирования в первичной культуре клеток почки кролика (ППК) с последующим клонированием методом предельных разведений и селекцией по признаку снижения репродукционной активности при температуре 40°C. Культурально-морфологические, физико-биологические признаки, антигенные свойства штамма раскрыты в описании к патенту. Однако данный штамм обладает недостаточно высокой иммуногенностью.

Изобретение направлено на создание универсального штамма, пригодного для использования в производстве краснушных вакцин и диагностических препаратов для диагностики краснухи на территории РФ

Технический результат - повышенная репродуктивная, гемагглютинирующая и имуногенная активность штамма без реверсии патогенных свойств, а также расширение области его применения.

Для достижения указанного технического результата авторы внесли изменения в технологию культивирования штамма. В качестве продуцента МИБП использован штамм вируса краснухи "Орлов-В" после десятилетнего хранения. Авторы изменили условия заражения клеток-продуцентов и многократно пассировали вирус в измененных условиях.

Вакцинный штамм «Орлов-В» получен при суспензионном способе заражения клеточной культуры ППК. В таких условиях заражения возможность для адсорбции на поверхности клеточных мембран имеют все вирусные частицы, не зависимо от их репродукционной активности, поскольку заражающий материал не удаляется. Следствием чего является получение популяции вирусных частиц, различающихся по репродукционным свойствам. Для получения однородной популяции с заданным свойством высокой репродукционной активности суспензионный способ заменен заражением клеток на сформированный монослой клеток с временем адсорбции, равным 20 мин. В этих условиях преимущество для прикрепления к клеточным рецепторам имеют вирусные частицы с наибольшей репродукционной активностью. В гетерогенной популяции исходного «дикого» вируса краснухи способность определенной доли вирусных частиц к активной репродукции в клетках хозяина обеспечивает реализацию патогенных свойств вируса. Для получения штамма «Орлов» (U) использовали штамм-продуцент «Орлов-В», аттенуированный многократным пассированием в иной системе хозяйских клеток (культура ППК). Это позволяет рассчитывать на высокую иммуногенную активность полученного штамма без реверсии патогенных свойств.

В результате получен штамм «Орлов» (U) с измененными свойствами: высокими показателями репродуктивной, гемагглютинирующей и иммуногенной активности.

Штамм «Орлов» (U) прошел лабораторные испытания на подлинность, специфическую активность и отсутствие контаминирующих агентов.

Штамм «Орлов» (U) депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» для целей национальной патентной процедуры. Регистрационный номер V-1 от 18.01.2011 г. №169а.

Таксономическое положение штамма «Орлов» (U): семейство Togaviridae, род Rubivirus.

Штамм "Орлов" (U) характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. При электронном микроскопировании популяция представляет однородные сферические частицы с диаметром 50-70 нм. Плавучая плотность в градиенте сахарозы 1,18-1,20 г/см³. Размножается с развитием цитодеструктивного действия до титра 5-6 lg ТЦД₅₀/0,5 мл в клеточных культурах животных и человека. Слабо размножается в первичных тканевых культурах куриных и перепелиных фибробластов. При роллерном или суспензионном способах культивирования на клетках ВНК-21 выход вирусной биомассы 7-8 lg ТЦЦ₅₀/0,5 мл. Не размножается при температуре ниже 20°C и выше 40°C. Оптимальная температура культивирования в тканевых культурах +35°C.

Физиолого-биохимические признаки. Оптимум pH=7,4. Инактивируется в течение 30 мин при 56°C. Чувствителен к действию эфира и ацетона.

Антигенные свойства. Гемагглютинирующая активность in vitro составляет 16-32 ГАЕ. Агглютинирует эритроциты голубей, 1-дневных цыплят, человека с группой крови 0.

Токсичность. Штамм не токсичен при введении морским свинкам и мышам в дозе 1000 ТЦД₅₀/0,5 мл /1 прививочная доза человека.

Штамм не обладает остаточной нейровирулентностью и контагиозностью.

Иммуногенные свойства. При однократном внутримышечном введении препарата из штамма «Орлов» (U) обезьянам макака - резус наблюдается 100% сероконверсия с обратными значениями титра антител в РТГА от 640 до 1280 ГАЕ.

Пример 1. Способ получения штамма «Орлов» (U).

Из 1-литровый матраца с сформированным монослоем тканевой культуры ППК удаляют ростовую среду 199, содержащую 10% сыворотки эмбрионов коров (ЭС), монослой 6-кратно отмывают от сыворотки раствором Хенкса pH 7,4, после чего вносят 5 мл среды 199, содержащей вирус краснухи шт."Орлов-В" в заражающей дозе 0,01 ТЦД₅₀/кл. и оставляют при комнатной температуре на 20 мин, покачивая матрац каждые 2-3 мин для орошения вируссодержащей жидкости (ВСЖ) всей поверхности монослоя клеток. Через 20 мин. ВСЖ удаляют, зараженные клетки заливают 150 мл поддерживающей среды 199 и инкубируют в термостате при температуре 34°C в течение 2 суток для селекции вирусных частиц с высокой адсорбционной и репродукционной активностью. Через 2 суток, не дожидаясь ЦПД, характерных для вируса краснухи, ВСЖ из матраца удаляют и используют для последующего заражения монослоя новой партии клеток ППК, которое осуществляют по описанной выше схеме. Такую процедуру заражения повторяют четыре раза. При последнем, четвертом заражении клеток ППК вирусом время инкубации при 34°C продлевают до 18 суток. Через каждые 2-3 суток, по мере нарастания цитопатогенных изменений клеточного монослоя, характерных для вируса краснухи (наблюдают под микроскопом), вируссодержащую жидкость сливают во флаконы и хранят под резиновой пробкой при (-20)°C для последующего использования, а в матрац добавляют 150 мл свежей поддерживающей среды 199 и культивируют при тех же условиях. В данном примере осуществляют 4-5 полезных съема вируса (активность вируса не менее 4 lg ТЦЦ₅₀/0,5 мл).

Все операции выполняют в стерильных условиях. Выход вируса на различных на различных рабочих съемах представлен в табл.1.

Как видно из табл.1 и описания к патенту РФ №2081912, новый штамм «Орлов» (U) обеспечивает больший выход инфекционного вируса (на 0,4-1,0 ТЦД₅₀/0,5 мл), чем прототипный штамм «Орлов-В».

Вируссодержащий материал из индивидуальных вирусных сборов объединяют в объединенный вирусный сбор (ОВС), добавляют стабилизатор (желатину с сахарозой из расчета конечной концентрации 1 об%.). Полученный полуфабрикат вакцины разливают по 0,5 мл в ампулы и подвергают лиофильной сушке. При этом 500 мл полуфабриката сохраняют в жидком виде при (-20)°C для проведения лабораторных контролей.

После контроля на специфичность, стерильность и отсутствие посторонних агентов препарат из штамма «Орлов» (U) испытали на отсутствие остаточной нейровирулентности и иммуногенную активность на обезьянах макака-резус. Препаратом сравнения являлся прототип - вакцинный штамм «Орлов-В».

Определение остаточной нейровирулентности. Для контроля отсутствия остаточной нейровирулентности 10 серонегативных к краснухе обезьян макака-резус были разделены на 2 группы по 5 особей в каждой.

Одну группу животных заражали препаратом из штамма «Орлов» (U), другую - из штамма «Орлов-В». Заражение проводили интрацеребрально. Перед началом эксперимента животных погружали в глубокий наркоз, который достигался внутримышечным введением 10% раствора гексенала из расчета 1,0 мл на 1,0 кг массы животного.

Вируссодержащий материал вводили в объеме 0,25 мл в зрительный бугор каждого полушария головного мозга. Интрацеребральная доза соответствовала 10 прививочным дозам для человека и составляла 10000 ТЦЦ₅₀/0,5 мл.

Клиническое наблюдение за обезьянами проводили в течение 30 суток, на протяжении которых никаких клинических симптомов поражения центральной нервной системы не регистрировали.

Морфологические и гистологические исследования тканей и органов обезьян.

Головной и спинной мозг фиксировали в 10% нейтральном формалине. Блоки фиксированной нервной ткани заливали в парафин и приготовляли серийные срезы толщиной 8-10 мк, которые окрашивали тионином по методу Ниссля. Исследованию подлежали передняя центральная извилина, задняя центральная извилина правого полушария головного мозга, зрительный бугор, продолговатый мозг; шейное и поясничное утолщение спинного мозга. Структуры ЦНС идентифицировали при микроскопическом исследовании по стереотаксическому атласу мозга обезьян (Spinder R.S., Lee С. Stereotaxic Atlas of Monkey Brain Macaca Mulatta/AJniversity of Chicago Press, Chicago, USA - 1961. - 287 p.). Тест считался действительным, если не менее чем у 80% зараженных обезьян через 28 суток после заражения регистрировали образование вирусспецифических антител.

Морфологическое исследование. На вскрытии мозговых оболочек, а также ткани головного и спинного мозга с поверхности и на разрезе, как и при осмотре серозных полостей никаких патологических изменений ни у одного из животных каждой из двух групп обнаружено не было. При гистологическом исследовании в тканях головного и спинного мозга каждого подопытного животного патологических изменений в нейронах и глиальных клетках в исследованных областях ни в одном случае выявлено не было. Нервные клетки имели четкие контуры, светлое пузырьковидное ядро с крупной центрально расположенной нуклеолой и отчетливые глыбки нисслевского вещества в цитоплазме.

Таким образом, штаммы вируса краснухи «Орлов» (U) и «Орлов-В» не являются нейровирулентными, поскольку: у зараженных обезьян отсутствовали клинические признаки поражения неровной системы в течение всего периода наблюдения; при гистологическом исследовании тканей головного мозга зараженных обезьян отсутствовали поражения нейронов и глии вне зоны инокуляционной травмы; при исследовании сыворотки крови зараженных животных в РТГА в 100% случаев регистрировали антитела к вирусу краснухи, что подтверждает факт заражения. Следовательно, штамм «Орлов» (U) сохранил признак отсутствия нейровирулентности, присущий прототипу.

При испытании на иммуногенность 20 серонегативных к краснухе обезьян макака-резус были разделены на две группы по 10 животных в каждой. Одну группу животных прививали препаратом из штамма «Орлов», другую -из штамма «Орлов-В». Иммуногенную активность регистрировали через 28 суток после однократного внутримышечного введения обезьянам 0,5 мл препаратов из исследуемых штаммов. Прививочная доза соответствовала 1 прививочной дозе для человека - не менее 1000 ТЦД50. Определение титров антител в сыворотке крови иммунизированных обезьян проводили в РТГА. Все сыворотки крови были зашифрованы и исследовались одновременно. Результаты представлены в таблице 2. Как видно из таблицы, сероконверсии составляют 100% как в группе животных, привитых известным штаммом вируса краснухи «Орлов-В», так и предлагаемым штаммом «Орлов». Однако, титры антител у животных, привитых предлагаемым штаммом определялись в диапазоне 1:320-1:1280, тогда как у животных, привитых прототипным штаммом, титры антител накапливались до уровня 1:80 и выше, но не превышали значения 1:320. Средняя геометрическая титра антител составила в 1:559 для предлагаемого штамма против 1:215 для штамма-прототипа, то есть иммуногенная активность предлагаемого штамма существенно выше, чем у штамма-протипа.

Контагиозность штамма «Орлов» оценивали после 28 суток тесного контакта (нахождение в одной клетке) иммунизированных и не иммунных к краснухе обезьян. Как видно из таблицы 3, штамм «Орлов» утратил контагиозность, так как в сыворотке крови не привитых животных не определяли краснухо-специфичные антигемагглютинины.

Пример 2. Получение краснушного диагностикума для РТГА. Две партии клеток ППК использовали для заражения штаммом-прототипом «Орлов-В» и предлагаемым штаммом «Орлов» (U). Накопление вируссодержащего материала производили в литровых матрацах с монослоем клеток ППК, как описано в примере 1, заражая одну парию клеток штаммом «Орлов» (U), другую - штаммом «Орлов-В». Через 18 суток инкубации при 34°C матрацы с зараженной клеточной культурой 3-кратно замораживали в смеси сухого льда со спиртом с последующим оттаиванием при температуре 35°C. Культуральную среду вместе с клетками сливали во флаконы, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин и титровали отдельные пробы надосадочной жидкости в РГА с использованием эритроцитов односуточных цыплят для определения титров гемагглютинина. Вируссодержащий материал с титром не менее 4 ГАЕ в 0,05 мл объединяли и помещали в плоскодонную колбу, куда добавляли предварительно разведенный в 10 раз дистиллированной водой твин-80 до конечной концентрации 2% и помещали на магнитную мешалку для перемешивания в течение 15 мин при +4°C. Затем к смеси добавляли эфир в объеме, равном ½ объема вируссодержащей жидкости и перемешивали далее в течение 15 мин в тех же условиях. Полученную суспензию центрифугировали при 2000 об/мин в течение 30 мин. После центрифугирования осторожно отсасывали пипеткой слой жидкости, находящийся под слоем эфирной желеобразной массы, переносили его в открытые емкости для удаления остатков эфира и в полученный материал добавляли мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000. Полученный таким образом полуфабрикат диагностикума подвергали лиофильной сушке. Титр гемагглютинина в полученном по описываемому методу диагностикуме составил: для препарата из предлагаемого штамма «Орлов» (U) - 128-256 ГАЕ. В препарате из штамма «Орлов-В» гемагглютинирующая активность осталась на уровне 4-8 ГАЕ. Штамм «Орлов-В» представлен популяцией с преобладанием частиц, дефектных по признаку гемагглютинирующей активности, что исключает возможность его использования для промышленного производства гемагглютинирующего антигена, в отличие от предлагаемого штамма «Орлов» (U).

Как видно из приведенных примеров, использование предлагаемого штамма вместо прототипа позволяет сохранить безопасность использования (отсутствие остаточной нейровирулентности и контагиозности) и вместе с тем, повысить иммуногенность вакцины против краснухи. А также позволяет расширить область применения прототипа, а именно использовать в качестве производственного штамма для получения краснушного антигенного диагностикума.

Таблица 1 Титры штамма «Орлов» (U) к примеру 1 Номер съема вируса 1 2 3 4 5 6 Титр вируса в lg ТЦД₅₀/0,5 мл 4,8 5,7 6,5 6,4 4,5 3,9

Таблица 2 Результаты сравнительного испытания иммуногенности вакцин из предлагаемого и известного штаммов вируса краснухи № Штамм, использованный для иммунизации Титры антител в РТГА 1 «Орлов» (U) 1:320 2 «Орлов» (U) 1:320 3 «Орлов» (U) 1:640 4 «Орлов» (U) 1:640 5 «Орлов» (U) 1:1280 6 «Орлов» (U) 1:320 7 «Орлов» (U) 1:640 8 «Орлов» (U) 1:1280 9 «Орлов» (U) 1:640 10 «Орлов» (U) 1:320 11 «Орлов-В» 1:160 12 «Орлов-В» 1:320 13 «Орлов-В» 1:160 14 «Орлов-В» 1:320 15 «Орлов-В» 1:320 16 «Орлов-В» 1:320 17 «Орлов-В» 1:160 18 «Орлов-В» 1:160 19 «Орлов-В» 1:320 20 «Орлов-В» 1:80

Таблица 3 Титры антител в сыворотке крови обезьян, иммунизированных и не иммунизированных штаммом «Орлов» (U) № клетки Штамм, использованный для иммунизации Титры антител в РТГА 4 «Орлов» (U) 1:640 4 Контактная <1:10 5 «Орлов» (U) 1:1280 5 Контактная <1:10 8 «Орлов» (U) 1:640 8 Контактная <1:10

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, а именно к штамму вируса краснухи. Штамм обладает повышенной репродуктивной, гемагглютинирующей и иммуногенной активностью. Штамм депонирован под номером V-1 в коллекции «ГКПМ-Оболенск». Штамм может найти применение для производства моновакцины против краснухи, ассоциированных комбинированных вакцин, содержащих вакцинный штамм вируса краснухи, а также для производства диагностических препаратов. 3 табл., 2 пр.

Штамм вируса краснухи, семейство Togaviridae, род Rubivirus, коллекция «ГКПМ-Оболенск», регистрационный номер V-1 для получения медицинских иммунобиологических препаратов.