Способ диагностики атеросклероза Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно } иммунологическим способам диагностики, и может найти применение при диагностике сердечно-сосудистых заболеваний, в частности прогрессивных форм атеросклероза.

Цель изобретения - повышение точности СПОСОбЯо

Способ осуществляется следующим образом.

10 МП венозной крови пациента делят на две части. Из первой получают лейкоциты обычным способом, из второй - липопротеиды преципитацион- ным способом - (зсаждением гепарином в в присутствии солей кальция, Лпя к 1 мл плазмы крови прибавляют 10 мп дистиллированной воды, 0,25 мл 2М раствора кальция хлористого (СаС) и 0,08 мл гепарина (5000 ед./мл). Затем зту смесь центрифугируют при 3000 об о/мин при 4 С в течение 1 ч. Образовавшийся осадок растворяют в 2 мл 5%-ного раствора натрия хлористого и разбавляют в 20-50 раз физиологическим раствором хлористого натрия для получения раствора липопротеидов с концентрацией 10-150 мкг/мл. Затем в 2 лунки, проделанные в слое (3-4 мм) агарозы, вносят 0,1 мл взвеси лейкоцитов в физиологическом растворе. После этого в одну лунку добавляют 0,1 мл физиологического раствора (контроль).

СП

to

;о

1C

а в другую - 0,1 мл раствора липопро теидов в концентрации 10-150 мкг/мл. Полученную систему инкубируют при во влажной атмосфере с 2% С02 в течение 8 ч.

Величину пробега лейкоцитов (зону миграции) в обеих лунках определяют под микроскопом. При уменьшении миграции лейкоцитов во второй лунке по сравнению с контролем на 30% и более судят о наличии аутосенсибили- эации и тем самым о прогрессирующем характере атеросклеротического процесса.

П р и м е р 1. Больной И.,51 год Поступил в клинику 25,03.86. Клинический диагноз: ишемическая болезнь сердца (ИБС). Атеросклероз коронарных артерий. Нестабильная стенокар- дияJ прогрессирующая стенокардия напряжения, 111-й функциональный класс, повторные приступы острой коронарной недостаточности, Атеросклеротический и постинфарктный кардиосклероз (ост рый инфаркт миокарда в 1983 г.).

14 апреля 1986 г. у больного из вены берут 10 мл крови для реакции ингибиции миграции лейкоцитов (РИМЛ) Из 5 мл получают лейкоциты, из дру- гик 5 мл - липопротеиды,

К 1 мл плазмы крови прибавляют 10 мл дистиллированной воды, 0,25 мл 2 М раствора СаС и 0,08 мл гепарина (5000 еДо/мл). Смесь тщательно перемешивают и помещают в холодильник при 4°С на 1 ч. После этого смесь центрифугируют при 3000 в течение часа, Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок растворяют в 2 мл 5%-ного раствора хлористого натрия,.Получившийся раствор разбавл ют в 50 раз физиологическим раство- ромо Тем самым концентрацию липо- протеидов доводят до 10 мкг/мл Кон- центрацию белка определяют по Лоури,

К 100 мг порошка агарозы (Sigma) приливают 8 мл би-дистиллированной воды, и смесь помещают в водяную баню до полного растворения агарозы. В растворенную теплую агарозу вливают 1,5 мл физиологического раствора; 4,25 мл дистиллированной воды; 1,5 мл человеческой сыворотки; 0,3 мл бикарбоната натрия и 0,02 мл раствора пенициллина, содержащего 25000 едо в 1 мл,

Всю смесь тут же разливают по микрочашкам Петри, по 3 мл в каждую

д 5

0 5

Q

- г

0

5

чашку. После застывания (примерно через 20 мин) в агарозе пробивают стандартным пробойником лунки (З мм в диаметре).

Взвесь лейкоцитов получают путем лизиса эритроцитов хлористым аммонием. К взвеси лейкоцитов приливают 0,85%-ный раствор хлористого аммония, и смесь трижды центрифугируют при 3000 об,/мин по 7 миНо Полученный осадок клеток ресуспендируют путем добавления 0,4 мл физиологического раствора,

В 2 лунки чашки Петри вносят по 0,1 мл взвеси лейкоцитов,. затем в первую добавляют 0,1 мл физиологического раствора (контроль) во вторую - 0,1 мл аутолипопротеидов. Чашки инкубируют при 37 С во влажной атмосфере с 2% СО в течение 8 ч„

Под микроскопом (увеличение в 200) с помощью окуляр-ми-крометра в обеих лунках измеряют величины пробега лейкоцитов, В первой - 15 уел едо, а во второй - 9,3 усл„ед., т„е, наблюдаемое сокращение пробега во второй лунке составило 62%.

18 апреля 1986 г. больной скончался от острой сердечно-сосудистой недостаточности, которой предшествовал затяжной приступ спонтанной стенокардии.

При патологоанатомическом исследовании коронарных артерий и аорты отмечено прогрессирующее развитие ате- росклеротических поражений, поскольку наряду с фиброзными бляшками видно образование свежих липидных пятен, сливающихся между собой, В атероскле- ротических бляшках наблюдается слоистое распределение соединительной ткани и пенистых клеток, что указывает на волнообразное течение процесса, характерное для быстротекущего процесса с иммунологическим компонентом. Однако, проведенное ранее исследование РИМЛ с донорскими липо- протеидами не выявило торможения миграции лейкоцитов по сравнению с контролем, и тем самым показало отсутствие сенсибилизации,

П р и м е р 2, Больной А,, 60 лет Клинический диагноз: ИБС. Атеросклероз коронарных артерий. Стенокардия напряжения 11-го функционального класса, Атеросклеротический кардиосклероз Гипертоническая болезнь II- 11-й стадии. Более 10 лет страдает

5

гипертонической болезнью медленно прогрессирующего течения с хорошим эффектом гипотензивной терапии, В 1979 г. появилась стенокардия напржения - сжимающие боли за грудиной возникают на фоне длительной физической нагрузки, при подъеме по лестнице на 111-й этажо Стенокардия носит не тяжелый, стабильный характер.

При постановке РИМЛ с использованием аутолипопротеидов, разбавленных в 30 раз (АО мкг/мл), не наблюдалось торможения миграции лейкоцитов по сравнению с контролем, также как и при постановке РИМЛ с донорскими ли- попротеидами, как в прототипе. Течение заболевания стабильное, без признаков обострения и прогрессированиЯо

С помощью предлагаемого способа изучено 305 больных ИБС, из них у 93 обнаружена прогрессирующая форма втеросклеротического процесса (по прототипу - 29 больных), некоторым больным назначена иммунокорректирую- щая терапия.

Предлагаемый способ, основанный на реакции с собственными липопро- .

0

91

0 5

5

L

теидами, исключительно точен и .однозначный ответ, что позволяет dBo- евременно назначить больным соответствующую иммунокорректирующую тера- п11Ю, Способ-прототип приблизительно в 30% случаев не позволяет выявить прогрессирующее течение заболевания, что связано с серьезными осложнениями для больного. Способ очень быстр в исполнении, его продолжительность - около 12 ч, в то время как способа- прототипа - более 1 суто

f

Формула изобретения

Способ диагностики атеросклероза путем добавления к лейкоцитам больных липопротеидов с последующей оценкой реакции ингибиции миграции лейкоцитов и при наличии ингибирования реакции диагностируют атеросклероз, отличающийся тем, что, с целью повышения точности диагностики прогрессирующего течения атеросклероза, к лейкоцитам добавляют липопротеиды, полученные из крови того же больного.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологическим методам диагностики, и может найти применение при диагностике сердечно-сосудистых заболеваний, в частности прогрессивного течения атеросклероза. Цель изобретения - повышение точности способа. Производят забор крови от больного, разделяют ее на две порции. Из одной порции получают аутологичные липопротеиды путем осаждения белков сыворотки в присутствии хлористого кальция, а из другой порции выделяют лейкоциты. Затем ставят реакцию ингибиции миграции лейкоцитов в присутствии липопротеидов и при увеличении процесса мигрирующих клеток не более, чем на 30% по сравнению с пробой без липопротеидов диагностируют прогрессирующую форму атеросклероза. По сравнению с прототипом отмечается повышение точности диагностики на 30%.