Способ получения @ -каротина из суспензии водорослей рода DUNaLIeLLa в растворе хлорида натрия с концентрацией не менее 3 М Советский патент 1989 года по МПК C07C175/00 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения витаминов.

Цель изобретения - улучгаение качества ft -каротина и упрощение процесса.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделение Dunaliella из суспензий в рассоле продемонстрировано с применением рассола из естественного солевого озера. Такой рассол в достаточной степени насыщен хлористым натрием и он типичен для рассолов из таких источников в том отношении, что загрязнен глиной, галофильными бактериями и другими нежелательными материалами. Исследование показало.

что число клеток на единицу объема вьше того значения, которое обычно обнаруживают в таких естественных солевых водах, а также что такие клетки клавным образом жизнеспособны. В образце присутствовало лишь небольшое количество лизированных клеток и фрагментов свободного липида и свободного 13 -каротина. Индивидуальные неповрежденные клетки содержали повышенное количество -каротина относительно концентрации в них хлорофилла.

Клеточную суспензию пропускают через пробки из пористого адсорбента, вьтолненные из гидрофобных волокон найлона 66, полизЛира, по.чиакрилата,

ел

оо

00

ел

см

тефлона (по:штетрафторэтилена) и стекловаты, которую делали гидрофобной в результате обработки подходяци1 силаном. Было установлено, что в каждом случае имеет место хорошая адсорбция клеток Dunaliella и адсорбированные клетки водорослей удерживаются в ходе последующего промывания пробок несодержащим клеток насыщенным раствором, хлористого натрия для удаления оклюдированной глины, бактериальных клеток и других нежелательных материалов, которые присутствуют в исходной суспензии. Затем раствор хлористого натрия, имеюищй концентрацию ниже 1 моль, перколируют через пробки, на которые адсорбируются клетки водорослей, и при этом установлено, что указанные клетки легко десорбируются с адсорбента и удаляются из системы с жидким эффлю- ентом. Обнаружено, что регенерированные таким образом пробки из адсорбента .способны адсорбировать больше клеток Dunaliella из свежено образца солевого раствора и такой цикл многократно повторяют.

Адсорбция клеток Dunaliella на гидрофобный адсорбент позволяет осуществлять концентрирование клеток и облегчает извлечение содержащегося в них й-каротина. Установлено, что клетки Dunaliella, оставаясь адсорбированными на гидрофобном адсорбенте, могут разрушаться под действием растворителя, способного деструкти- ровать клеточную мембрану, и что растворитель позволяет экстрагироват -каротин, оставляя при этом клеточные осколки и нерастворимые клеточные компоненты адсорбированным- на гидрофобной поверхности.

Растворители, подходя1цие для такой цели, включают, но не ограничиваются хлорированными растворителями, такими как хлористый метилен, : хлороформ, четыреххлористый углерод и трихлорэтилен, и ароматическими углеводородами или смесями ароматических и алифатических углеводородов Дпя этой пели могут использоваться такие углеводороды, как бензол, толуол и пром),1шленные петролейные фракции, содержащие смеси ароматических или алифатических и ароматических углеводородов.Ароматические углеводороды по;1ходят для этой цели в большей степени, чем алифатические угле0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

водороды, поскольку они обладают большей способностью растворять ка- ротиновые компоненты. Л.чя последующего извлечения -каротина предпочитают использовать растворители с относительно низко точкой кипения, порядка 10П°С шт ниже. Подходящим растворителем для экстракции J-Ka- ротина является жидкая двуокись углерода и низкая точка кипения такого растворителя минимизирует тенденцию к разложению экстрагированных каро- тиновых компонентов в ходе их отделения и выделения.

Растворимый компонент содержит помимо ft -каротина также тритерпе- ноиды и -нипиды. Такие компоненты мо- г ут быть легко отделены от |3 -каротина, например, фракционной кристаллизацией и/или распределением между растворителем и они могут быть выделены для других назначе}1ий, например, в качестве химического сырья.

01еточные OCKOJUCH, остающиеся после экстракции й-каротина, могут десорбировать с адсорбентом в результате промывания последнего разбав- jieFfHb M раствором хлористого натрия шп1 водой согласно описанному способу, и регенерированный таким образом адсорбент может pennpKyjnipoBaTbCH на дальнейшее использование.

Клеточные осколки, представляющие собой протеиновый материал, могут быть изв1 ечены тгюбым подходящим способом и использованы, например, в качестве кормовой биомассы корма для животных или протеиновой добавки, пни в качестве протеинового источника для других применений.

Из промывочной ж дкocти может быть также извлечен вoднopacтвopи lый клеточный компонент, главным образом глицерин.

Пример 1. Стекловату спла- низируют и делают гидрофобной в результате погр окения на 10 мин в 10%-ный (об./об.) раствора дихлорди- метилсилана в гексане. Затем обработанную стекловату пять раз промывают дистиллированной водой. Колонку длиной 15 см и внешним диаметром 7 см тщательно набивают 90 г обработанной указанным способом стекловатой и 1,5 л суспезии Dunaliella Sa- lina к насыщенном растворе хчористо- гн натрия, солерж-тцем 10 клеток/мл, пр1)пускают черсч такую копонрсу с о

5153

скоростью 1,3 л/мин. Затем жидкости дают стечь из колонки и через нее пропускают 700 мл хлористого метилена. Отходяпщй хлористый метилен собирают и анализируют на содержание. В-каротина. Установлено, что в эффлю- енте содерткится 77% Ь-каротина, присутствующего в клетках, содержащихся в исходном растворе.

Затем стекловату реактивируют в результате пропускания 1,6 л дистиллированной воды через колонку с целью десорбции и быстрого отвода оставшихся клеточных осколков. Реактивированную стекловату повторно используют в идентичном эксперименте со следующим образцом той же суспензии клеток Dunaliella. Были по/гучены практически .идентичные результаты.

Пример 2. Магнетит (10 г), проходящий через сито с размером отверстий 20 меш, силанизируют 10%-ным (об./об.) раствором дихлорметилси- лана в гексане в течение 20 мин, затем промывают водой и сушат при 110 С. Силанизированный магнетит перемешивают с 50 мл суспензии, содержащей 2x10 клеток/мл Dunaliella в насыщенном растворе хлористого натрия в течение 10 мин. Затем силани- зированный магнетит удаляют из раствора с использованием постоянного магнита. Ю1етки, адсорбированные на магнетите, лизируют путем контактирования магнетита с хлористым метиленом, после чего хлористый метилен отделяют и анализируют на содержание в нем В-каротина. Установлено, что 87% каротина, присутствующего в исходной суспензии клеток Dunaliella, извлечено с хлористым метиленом.

Силанизированный магнетит реакти- руют в результате пятикратного промывания 10 мл порциями воды. Затем эксперимент повторяют с использованием реактивированного магнетита 70% В-каротина, присутствующего в клеточной суспензии Dunaliella, извлекли с хлористым метиленом.

Пример 3. Полиэфирное волокно (1 г) тщательно загружают в колонку длиной 20 см и внешним диаметром 1,5 см. Суспензию клеток Dunaliella Salina (2x10 клеток/мл) в насыщенном растворе хлористого натрия пропускают через колонку со скоростью 80 мл/мин. Затем волокно промывают

0

516

20 MJI насьпденнот о раствора хлористого натрия и дают жидкости стечь с колонки. Затем волокно переносят в Экстрактор Сосклета и экстрагируют четырех- хлористым углеродом. Анализ извлеченного экстракта показал, что 2,1 мг р-каротина получен из клеток Dunaliella, которые были адсорбированы на

Q (Полиэфирном волокне.

Пример 4. Повторя.гщ методику примера 3 за тем исключением, что полиэфирное волокно заменяли на 1 г g нейлонового волокна. Анализ экстракта показал, что бьто извлечено 0,5мг В-каротина.

Пример 5. Политетрафторэти- леновое волокно (1,5 г) активируют путем нагревания до 316°С в 98%-ной серной кислоте и для обесцвечивания смеси добавляют достаточное количество азотной кислоты. Волокно извлекают, промывают водой, сушат и исполь- 5 зуют в соответствии с методикой примера 3. р -каротин (0,4 мг на г волокна) извлекают экстракцией четырех- хлористым углеродом.

Пример 6. Акркповое волокно (1 г) обрабатывали согласно методике, описанной в примере 3. и выделяли 0,5 мг В-каротина.

Пример 7. Антра1;ит (12,5 г) размалывают так, что он проходит через сито с размером отверстий 120 меш (BSS) и затем перемешивают в течение 30 мин с насыщенным раствором хлористого натрия (250 мл), содержащим 2x10 клеток/мл Dunaliella Salina. Затем мешалку останавливают, смеси дают осесть перед тем, как сольют верхний слой жидкости и содержимое профильтруют через пробку из свободно упакованной стекловаты. Как осажденный материал, так и тот материал, что остался на фильтре, промывают насьпценным раствором хлористого натрия (20 мл). и промывные жидкости отбрасывают. Фильтр переносят в тот же контейнер, что и осадок, и объединенные твердые вещества промывают последовательными порциями хлористого метилена до тех пор, пока промывные жидкости не потеряют окраску, создаваемую присутствующим - каротином. Раствор хлористого метилена анализируют, обнаружено что он содержит 0,7 мг |3-каротина на грамм используемого антрацита.

0

0

5

0

Пример 8. Графит (12,5 г) использовали вместо антрацита и повторяли методику, ог1исаь1ную в примере 7. Раствор хлористого метилена анализировали и бьшо обнаружено, что он содержит 0,6 мг R-каротина на грамм графита.

Пример 9. Согласно методике описанной в примере 7, использовали халькопирит (12,5 г) и в результате извлекли 0,6 мг В-каротина на грамм халькопирита.

Пример 10. Сфалерит (12,5 г применяли по методике, описанной в примере 7. и в результате извлекли 0,25 мг ft -каротина на грамм сфале- ри та.

Пример 11. Пиролюзит (12,5 использовали по методике, описанной в примере 7, и извлекли 0,25 мг - каротина на грамм пиролюзита.

Пример 12, Рутил (12,5 г) использовали по методике, описанной в примере 7. и в результате извлекли 0,2 мг В -каротина на грамм рутила.

Пример 13. Ильменит (12,5 г использовали по методике, описанной в примере 7, и в результате получили 0,4 мг В -каротина на грамм илменита

П р. и м е р 14. Магнетит (12,5 г использовали по методике, описанной в примере 7. за исключением того, чт постоянный магнит применяли для отделения магнетита вместо фильтра из стекловаты. В результате извлекли 3,3 мг В -каротина на грамм магнетита .

Пример 15. 50г гэматита с размером частип примерно 120 меш (BSS) сушат при 105°С в течение одного часа и затем обрабатывают 1,4 г дихлорметилсилана в 290 мл петролей- ного эфира в течение 12 ч при 20 С. Затем петролейный эфир удаляют на фильтре с отсосом и обработанный гэ- матит сушат при 105°С в течение 1 ч. 10 г высушенного обработанного гэматита добавляют в одному литру суспензии клеток Dunaliella Salina в насыщенном растворе хлористого натрия. Затем гэматит извлекают декантацией и притяжением магнитом и экстрагируют 100 мл дихлорметана. Выделяют 81% р -каротина в расчете на количество, содержащееся в исходной суспенз П5 клеток Dunaliella Salina.

Пример 16. 50 г магнетита обрабатывают 2,5 мл аминопропилтри0

5

0

5

0

5

0

5

этоксисилана и 2,5 мл уксусной кислоты в 250 мл воды в течение 10 мин, затем жидкость частично удаляют в результате фильтрации с отсосом, оставляя при этом важный магнетит, который нагревают при 105 С в течение 5 ц для завершения реакции силана с магнетитом. Обработанный магнетит промывают 100 мл этанола и сушат при 105 С в течение одного часа. 10 г образца отбирают из полученной партии и используют согласно методике, описанной в примере 15. в результате чего извлекают 84% -каротина.

Пример 17. 1 кг магнетита с размером частиц примерно 100 меш (BSS) обрабатывают 2 л 1%-ного раствора дихлордиметилсилана в петролей- ном эфире в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем раствор пет- ролейного эфира удаляют фильтрацией под разрежением и обработанный магнетит сушат при 105°С в течение 1 ч. Готовят лне суспензии Dunaliella Salina в насыщенном растворе хлористо- ,го натрия, первая из которых содер- жит 0,5 мг/л, а вторая 5,0 мг/л Л - каротина. Порции высушенного магнетита смешивают с 3-литровыми алик- вотами суспензий Dunaliella Salina в течение 5 мин. Затем магнетит удаляют из солевых растворов с использованием магнита и экстрагируют 100 мл гексана. Гексановый раствор анализируют колориметрически на содержание /3-каротина в результате поглощения света с длиной волны 460 нм.

В табл. 1 приведены значения величины извлечения В-каротина при использовании указанных концентраций 0-каротина в суспензиях и указанных количествах магнетита.

Таблица 1

Пример 18. 500 г сухого маг нетита с размером части 120 мега (BSS) обрабатывают 1 л 1%-ного раствора дихлордиметилсилана в петролей- ном эфире при окружающей температуре в течение 3 ч. Обработанный магнетит отделяют от растворителя декантацией и сливанием с помощью магнита, сушат в течение 0,5 ч и затем размагничивают. Оставшиеся в смеси куски разбивают. Каждую из семи 3-литровых аликвот рассола, содержащего Dunaliella (с солевых копий) смешивают с 60 г силанизированного магнетита и тщательно перемешивают в течение 5 мин. Затем магнетит собирают с использованием магнита и сушат на фильтре, работающем под разрежением.

Полученные таким образом семь образцов магнетита, содержащих адсорбированные клетки Dunaliella, объединяют и ровно расцределяют по поверхности тонкой стекловаты, которую затем помещают на одну лопасть У-образного сосуда для работы под давлением. Затем этот сосуд переворачивают и вводят 500 мл жидкой двуокиси углерода (под давлением АООО кПа и 8 С) и этому растворителю дают повторно перколировать через стекловату путем многократного перевертывания сосуда. Затем жидкую двуокись углерода отводят и заменяют на свежую аликвоту жидкости. Используют три 500 мл аликвот жидкой двуокиси углерода. Испарение двуокиси углерода дает соответственно 0.36, 0,38 и 0,15 г красной маслообразной жидкости, которая закристаллизовывает- ся при охлаждении до -5°С с образованием 23 мг кристаллического 3 -каротина.

Пример 19. Стеклянную вату подвергают силанизации и наделяют гидрофобными свойствами при помощи погружения на 10 мин в 10%-ный (об./ /об.) раствор дихлордиметалсилана (силан А156 фирмы Юнион Карбайд) в гексане. Затем обработанную стеклянную вату промывают пять раз дистиллированной водой. Колонну длиной 15 см и с внешним диаметром 7 см аккуратно наполняют 90 г обработанной таким образом стеклянной ваты и 1,5 суспензии клеток Dunaliella Salina в насыщенном растворе хлорида натрия и содержащей 1,0x10 клеток/мл пропускают через эту колонну с объемной скоростью 1,3 л/мин. Собранный вытекающий поток (1,5 л) содержит 1,1х х10 клеток/мл, что указывает на то, что 89% клеток, введенных в колонну, адсорбируется на стеклянной вате.

Затем насыщенный раствор хлорида натрия (1,5 л), не содержащий клеQ ток, пропускают через колонну с той же объемной скоростью и так же собирают вытекающий поток. Установлено, что поток содержит некоторое количество бактериальных клеток и части, цы глины, причем, как то, так и другое содержится в исходной суспензии, но содержание клеток Dunaliella Salina в нем составляет менее 10 клеток/мл, что указьшает на то, что по

f. существу нет клеток, адсорбированных на стеклянной вате.

Затем через колонну пропускают 1 л 0,5 М раствора хлорида натрия в дистиллированной воде, не содержа-

5 шей клеток, при этом вытекающий поток собирают.

Установлено, что вытекающий поток содержит 1,3 X 10 клеток Dunaliella Salina/MJi, что соответствует 97%

Q клеток, которые адсорбированы на стеклянной вате.

Затем стеклянную вату регенерируют при ПОМО1ЧИ пропускания 1,6 л дис- циллированной во;ф1 через колонну с

тем, чтобы смыть любые оставишеся

клетки или осколки клеток. Регенерированную стеклянную вагу вновь используют для аналогичного эксперимента с еще одной пробой такой же суспензии Dunaliella, при этом получают идентичные результаты.

Пример 20. Проводят серию экспериментов в соответствии с процедурой, описанной в примере 19, затем исключением, что силанизиро- ванную стеклянную вату заменяют органическими полимерными волокнами. В каждом случае имеет место хорошая адсорбция клеток Dunalliella, причем

0 адсорбированные клетки водорослей удерживаются в том случае, когда через колонну пропускают свелоп насыщенный раствор хлорида натрия с тем, чтобы удалить поглощенные частиг1ы

5 глины и бактериальные клетки. По существу, все адсорбированные KJICTKTI водорослей десорбируются, когда их пропускают через колонну П,5 М рлсг0

5

вор хлорида натрия. Результаты экспериментов приведены в табл. 2.

Таблииа2

Политетрафторэтилен, активированный перед использованием нагреванием до 316 С в 98%-ной серной кислоте с добавлением достаточного количества азотной кислоты для того, чтобы V сделать смесь бесцветной. Волокно затем извлекают, промывают водой и суишт перед использованием.

Как и в дополргительном примере 19 волокна регенерируют при помощи пропускания воды через колонну, а затем вновь используют в идентичных экспериментах с другими пробами такой же суспензии Dunaliella, в результате были получены по существу аналогичные результаты.

Пример 21. Магнетит (10 г), пропуп1енный через сито в 120 меш (ESS), диаметр отверстия сита О,123мм подвергают силанизации с использованием 10%-ного (об./об.) раствора ди- хлордиметилсилана в гексане в течение 20 мин, затем промывают водой и сушат при 110 С. Силанизированный магнетит перемешивают с 50 мл суспен- зии, содержащей 2x10 клеток на мл Dunaliella Salina, в насыщенном растворе х-порида натрия в течение 10 мин после чего силанизированный магнетит извлекают из раствора при помоищ постоянного магнита.

0

5

0

5

5

0

Установлено, что раствор содержит 3x10 клеток/мл, что указывает на то, что 85% клеток, первоначально содержащихся в суспензии, бьиго адсорбировано на магнетите.

Затем магнетит суспендируют в 50 мл насып1енного раствора хлорида натрия, не содержащего клеток, перемешивают в течение 10 мин и извлекают, как это делалось ранее. Установлено, что раствор содержит 1,2x10 клеток/мл, что указывает на то, что по существу клетки не десорбируются с магнетита.

I

Затем магнетит пе1)емеш11вают с 30 мл 0,5 М растпора хлорида натрия, не содержащего клеток, в течение 10 мин и его извлекают, как это делалось ранее, п результате оставшийся раствор содержит 2,6x10 Dunaliel- 1а/мл, что соответствует 92% десор- бированля клеток, ранее адсорбированных на магнетите.

Силанизированн1.г1 магнетит регенерируют при помощи пятикратной промывки порциями fl 10 мл воды. Затем повторяют эксперимент, в результате чего устанавливают, что 837, клеток, i первоначально содержащихся в суспензии, было адсорбировано на магнетите, и 93% этих адсорбированных клеток было десорбировано при помоищ 0,5 М раствора хлорида натрия.

Пример 22. Следуют процедуре из примера 21 за тем исключением, что магнетит з.чменяют на железняк. Установлено, что 82% клеток Dunaliella адсорбировано на красном железняке и что адсорбированные клетки не десорбировались насьпценным раствором хлорида натрия. После перемешивания нагруженного красного железняка с 0,5 N раствором хлорида натрия было десорбировано 95% адсорбированных клеток.

Пример 23. Следуют процедуре из примера 21, причем силанизированный магнетит заменяют серией гидрофобных минералов, так как эти минералы были немагнитными, они удалялись из раствора при помопш оса)ц1,ения и декантации верхнего слоя ; п1дкости через фильтр, содержащий не очень сильно уплотненную прокладку ит стекляр - ной ваты. Резу 111,таты ириредены в табл. 3,

13 т а б

лица

1851

пользовании 0,5 М раствора хлорида натрия.

Изобретение позволяет получить р-каротин.фактически не содержащий нежелательных каротиноидов, липидов и т.п., источником которых служат галобактерии, кроме того, изобретение позволит упростить способ за счет исключения сложных операций фильтрования или центрифугирования.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения витаминов. Целью изобретения является улучшение качества β-каротина и упрощение процесса. Это достигается тем, что водоросли рода DUNALIELLA в растворе хлорида натрия концентрацией не менее 3М контактируют с гидрофобным корпускулярным или волокнистым адсорбентом, обрабатывают водоросли растворителем для экстракции β-каротина, свободного от нежелательных каротиноидов и липидов, а затем отгоняют растворитель из экстракта.

Из табл. 3 видно, что хорошая адсорбция клеток Dunaliella имеет место из насыщенного раствора хлорида натрия и что исключительно высокая десорбция достигается при исФормула изобретения

Способ получения -каротина из суспензии водорослей рода Dunaliella в растворе хлорида натрия с концентрацией tie менее 3 М. включающий отделение раствора хлорида натрия от

водорослей, экстракцию водорослей растворителем и удаление последнего из экстракта, отличающий- с я тем, что, с целью улучшения качества PI -каротина и упрощения процесса, отделение раствора хлорида натрия от водорослей ведут контактированием суспензии с корпускулярным или волокнистым гидрофобным адсор- бантом.