Способ очистки суспензии вируса от клеточной ДНК Советский патент 1989 года по МПК A61K39/00 A61K39/12 C12N7/00 

Изобретение относится к медицине, микробиологии, в частности к производству вакцинных препаратов.

Согласно требованию ВОЗ, содержание клеточной ДНК в вакцинах медицинского назначения, приготовленных на основе вирусных сборов с перевиваемых клеточных линий, жестко лимитируется величиной не более 100 пг на дозу, так как нельзя полностью исключить трансформирующей клетки и онкогенной активности такой ДНК.

Цель изобретения - упрощение способа и повышение степени очистки вирусной суспензии от клеточной ДНК путем обработки суспензии протамин сульфатом в концентрагщи 4J1 мг/мл

с последующей ее очисткой ультрацентрифугированием или гельхроматографи- ей.

Способ осуществляют следующим об- разомо

Вирус клещевого энцефалита или гепатита А, размноженный при 37 С в течение 48-72 ч или 14 сут соответственно в перевиваемой культуре клеток, пермессивной для вируса и разрешенной для вакцинного производства, концентрируют и очип(ают от балластных примесей„ Для этого используют обычно следующие последовательные процедуры: осветляющее центрифугирование при 5000-10000 xg или фильтрацию через мембранные фильтры с диаметром пор

СП

со to о СП

200-500 нм и ультрафильтрацию через мег4браны с диаметром пор 5-50 нм К полученному концентрату добавляют протамин сульфат до конечной кон- центрации 41.1 мг/мл и инкубируют в течение получаса при 4 С. Образовав- шийся преципитат удаляют центрифугированием при 4-12 Tbic.xg в течение 30 мин, Остйток клеточной ДНК и про- т-амин сульфат удаляют центрифугированием при 75 тыс о xg в течение 3 ч через 15% сахарозу или гельхроматогра- фией на сорбентах типа Сефароза 6В; 4В; CL-6fi; CL-4B или кремнезем МПС-1000П-МПС-2000П. Количество клеточной ДНК в препаратах на последовательных стадиях очистки измеряют методом точечной гибридизации о Чувствительность метода 2,5 пг/мл. В опыте для вируса клещевого энцефалита при выходе вируса порядка 90% концентрация клеточной ДНК снижается с 1-3 мкг/мл в концентрате до 200- 400 пг/мл в очищенном препарате полу фабриката, а после дополнительного разведения до согласованных уровней иммуногенности эта величина составляет менее 100 пг/мл. В случае суспензии вируса гепатита А при том же выходе антигенного материала количество клеточной ДНК снижается до 1- 90 пг/мл.

Пример 1 о Очистка суспензии вируса клещевого энцефалита от клеточной ДНК с применением протамин сульфата с последующим ультрацентрифгированием. Вакцинный штамм вируса клещевого энцефалита, размноженный в перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (4647) при 37 С в течение 72 ч объемом Зле титром инфекционных частиц Ю БОЕ/мл, осветляют центрифугированием при 10 тыс xg в течение 30 мин, фильт- руют через нитроцеллюлозные мембраны Миллипор НА и концентрируют в 20 раз на полиядерных мембранах с диметром пор 50 нм, К вирусному конценрату добавляют протамин сульфат в конечной концентрации 5 мг/мл. После инкубации в течение 30 мин при 4°С преципитат удаляют центрифугированием при 10 тыс, xg в течение 30 мин Надосадок ультрацентрифугируют в 15%-ном растворе сахарозы при 75 тыс X g в течение 3 ч. Осадок, содержащий вирус клещевого энцефалита, ре- суспендируют до исходного объема в

, д

0

5

0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 с 0,14 М NaCl. В вирусном концентрате, а также в материале осадка определяют количество клеточной ДНК методом точечной гибридизации с ник-транс- лированной гомологичной ДНК. Содержание ДНК в препарате 200 пг/мл, а после дополнительного разведения до нужного уровня иммуногенности - от 10 до 40 пг в дозе„ Степень очистки от клеточной ДНК около 100 тыс, раз, при высоком выходе вирусного антигена - более 90% (табл,1 и 2),

Пример 2, Очистка суспензии вируса клещевого энцефалита от клеточной ДНК с применением протамин сульфата с последующей гельхроматографи- ей. Надосадок после обработки протамин сульфатом и удаления клеточной ДНК аналогично примеру 1 подвергают гельхроматографии на колонке 5x40 см, заполненной кремнеземом MIIC-2000 П, Для элюции вирусного материала используют среду 199 или 0,1 М фосфатный буфер рН 7,4 с 0,14 М NaCl, Содержание ДНК в конечном препарате 300 пг/мл или 14-57 пг в дозе после дополнительного разведения.

Пример 3, Очистка суспензии вируса клещевого энцефалита от клеточной ДНК с применением протамин сульфата в сниженной концентрации. К вирусному концентрату, полученному аналогично примеру 1, добавляют протамин сульфат в концентрации 0,5 мг/мл. После инкубации в течение 30 мин при 4 С преципитат удаляют центрифугированием при 10 тыс, xg в течение 30 мин, Дальнейщие процедуры очистки вьтолняют аналогично примеру 1. Содержание ДНК в конечном препарате 900 пг/мл или 43-170 пг в дозе после дополнительного разведения.

Пример 4, Очистка суспензии вируса гепатита А с применением протамин сульфата и последующей гельфильт- рации. Вирус гепатита А (щтамм HAS-15/4647 или Л-2424) размножают на монослое перевиваемых клеток 4647 при 37 С в течение 21 сут с еженедельной сменой среды. Суспензию инфицированных клеток (титр инфекционной активности 7,5 Ig ТкИДуд/мл: антигенный титр 1:32-64) в 0,1 М фосфатно- солевом буфере рН 7,4±0,2 (ФСБ) подвергают звуковой Обработке (3x20 с) при 14 кГц и осветляют низкоскоростг ным центрифугированием (5000 xg.

5 мин)„ Супернатант, содержащий вирус, трижды обрабатывают равным объемом охлажденного (0°) фреона-113, интерфазу дополнительно экстрагируют О,1 М ФСБ и объединяют вируссодер- жащие водные фазы. Надклеточнуто жидкость, собранную при сменах среды, концентрируют ультрафильтрацией на мембранах (РТНК фирмы Миллипор, CUiA) и полученный вирусный концентрат объединяют с указанной вируссодержа- щей водной фазой. Объединенную, вирусную суспензию обрабатывают (30 мин, А С) протамин сульфатом в конечной концентрации 3 мг/мл, осадок отделяют низкоскоростным центрифугированием (400 xg, 10 мин, 4 с), а сусперна- тант фракционируют на колонке с Сефа- розой 4В (Фармация, Швеция), Во фрак- циях с колонки определяют содержание вирусного антигена и клеточной ДНК (см, таблоЗ).

Пример 5, Очистка суспензии вируса гепатита А с применением ДНКазы, протамин сульфата и последующей гельфильтрацией. Вирусную суспензию, полученную аналогично примеру

4, обрабатывают хлороформом, продувают газообразным азотом до полного его удаления и обрабатывают (37 С, 60 мин) дезоксирибонуклеазой 1 (Серва, ФРГ) или ДНКазой из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Дальнейшую обработку протамин сульфатом и фракционирование осуществляют аналогично примеру 4, используя для хроматографии колонку с сорбентом СМП-1М- 1000.

Формула изобретения

Способ очистки суспензии вируса от клеточной ДКК, включающий его вьфа щивание на клетках перевиваемой клеточной линии, осветление, концентрирование путем ультрафильтрации с последующей хроматографией или центрифугированием в слое сахарозы, отличающийся тем, что,.с целью упрощения способа и повьппения степени очистки вирусной суспензии от клеточной ДНК, полученный концентрат обрабатывают протамин сульфатом в конечной концентрации 4±1 мг/мл„

Изобретение относится к медицине, микробиологии, в частности к производству вакцинных препаратов. Цель изобретения - упрощение способа и повышение степени очистки вирусной суспензии от клеточной ДНК. Для этого к суспензии вируса, выращенного на клетках перевиваемой клеточной линии, добавляют протамин сульфат до концентрации 4±1 мг/мл и затем удаляют образовавшийся преципитат центрифугированием, а надосадок подвергают дополнительной очистке хроматографией или ультрацентрифугированием через слой сахарозы. Итоговая концентрация клеточной ДНК в препаратах, пригодных в качестве парэнтеральных вакцин, не превышает 100 пг/мл. 3 табл.

Таблица

Влияние концентрации протамин сульфата на полноту удаления клеточной ДНК из концентрированной суспензии вируса клещевого энцефалита

1,2 1,2

900 600

400

300

т а б л и ц а

Результаты применения протамин сульфата для очистки коидентрированной суспензии вируса

клещевого энцефалита от клеточной ДНК

Вирусный концентрат до очистки

Вирусный концентрат после обработки:

протамин сульфата (5 мг/мл) и центрифугирования через 15Z сахарозу (пример 1)

протамин сульфата (5 мг/мл) и гельхромато- графии на МПС-2000П (пример 2)

протамин сульфата (0,5 мг/мл) и центрифугирования через 15Z сахарозу (пример 3)

1,2-10 (55-210) 1о 3,210 (100) 5,7(100)

200 10-iiO

300 К-57

2,9- И, (90) 5,2(90)

З.О Ю (90) 5,3(90)

900 43-170 2,910 (90) 5,2(90)

Количество препарата, достаточное для получения икунного ответа у человека- соответствубт примерно 50 МИЛ JQ (минимальных иммунизирующих доз, защищающих мышей от смертельного заражения вирусом кл, энцефалита) или 0,25-1,0 мкг протектив- ного антигена Е в составе вирионной вакцины на I инъекцию. Титрование методом бляшек на культуре СПЭВ.

Метод злектрофореза с использованием стандартного антигена Е. Определяют jjTo количеству MHfljo в 1 мл препарата с поправкой на разведение материала.

Таблица 3

Результаты обработки протамин сульфатом суспензии вируса гепатита А

tn

4,65 100 4, 10 88

6,15 100 6,25 102

100

2,9- И, (90) 5,2(90)

З.О Ю (90) 5,3(90)

93

1x10 100

9x10

1x10

-5

5x10 100

1

«::2х10

-5