Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии и медицине, и представляет собой рекомбинантный штамм вируса осповакцины (ВОВ), полученный с помощью методов генетической инженерии и предназначенный для разработки живой вакцины против клещевого энцефалита (КЭ).
Клещевой энцефалит - природно-очаговое заболевание вирусной природы, характеризующееся поражением центральной неровной системы и высокой летальностью [1]. Его возбудителем является вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) из рода Flaviviruses. Вирус циркулирует в природных очагах, заражение человека осуществляется через укус иксодовых клещей, проявляющих наибольшую активность в весенне-летний период.
Эффективным способом борьбы с КЭ является вакцинация. Применяемые с этой целью препараты инактивированной вакцины привели к значительному снижению заболеваемости КЭ [1] . Однако возникающий при такой вакцинации иммунитет кратковременен и требует повторных ежегодных прививок. Этих недостатков лишена живая аттенуированная вакцина против КЭ, но ее применение приостановлено из-за случаев заболевания КЭ, возникающих в результате вакцинации [1].
В последние годы для разработки вакцин активно используется методология конструирования рекомбинантных вирусов [2].
При встройке в вирус осповакцины части генома ВКЭ, кодирующей основные иммуногенные белки, можно ожидать получения живой рекомбинантной вакцины, не вызывающей в качестве осложнения заболевания КЭ. Использование вируса осповакцины в качестве вектора обеспечивает правильный процессинг экспрессируемых антигенов и формирование сильного клеточного иммунного ответа in vivo [3, 4] .
Вектор осповакцины был широко использован для экспрессии генов флавивирусов и изучения их протективного эффекта на животных против заражения аутологичными вирулентными штаммами. Так была продемонстрирована защита мышей при иммунизации рекомбинантными ВОВ, экспрессирующими гены вируса Денге-4: E [5, 6], C-prM/M-E-NS1-NS2A [5], NS1-NS2A [7], а также prM и E вирусов Денге-2 и японского энцефалита [8, 9].
Наиболее близким техническим решением в данной области является рекомбинантная плазмидная ДНК p28 CME, кодирующая синтез полипептидов для получения живой рекомбинантной вакцины против клещевого энцефалита [10, прототип, А.с. СССР N 1490963, кл. C 12 N 15/00, 1993 г.]. Данная плазмидная конструкция содержит комплекс генов ВКЭ C, M и E, кодирующий все структурные белки вируса за исключением N-концевых аминокислот белка C и C-концевой части белка E под контролем позднего промотора p28k вируса осповакцины. Однако, полученный предложенным способом рекомбинантный вирус осповакцины не является перспективным для создания эффективной вакцины против КЭ, так как имеет слабые протективные свойства по сравнению с контрольной инактивированной вакциной КЭ.
Известен штамм рекомбинантного вируса осповакцины V7, 5c-продуцент корового антигена вируса гепатита B, обеспечивающий экспрессию C-гена вируса гепатита B в клетках млекопитающих [11, патент РФ N 1788012, кл. C 12 N 15/00, 1993 г.]. В патентной и научно-технической литературе не обнаружено сведений о штамме вируса осповакцины, продуцирующем белки вируса клещевого энцефалита.
Известно, что экспрессия генов ВКЭ осуществляется посредством синтеза единого полипептида, который затем разрезается на отдельные белки клеточными протеазами и протеазами вирусной природы [12].
Известно, что основными иммуногенами являются структурные белки prM/M (предшественник мембранного белка и мембранный белок), E - белок вирусной оболочки и неструктурные белки NS1 и NS3 [13]. Кроме того, показана функциональная роль белка prM и вирусоспецифичной протеазы MS2B/NS3 в сборке и секретировании высокоиммуногенных E-содержащих вирусоподобных частиц [14, 15, 16] . Неструктурный белок NS2A, по-видимому, участвует в процессинге белка NS1 в высокоиммуногенную форму [7].
Кроме того, в неструктурных белках NS3, NS1 или NS2A, NS4A или NS4B вирусов Денге обнаружены эпитопы для T-хелперов и цитотоксических лимфоцитов человека и мыши [17, 18, 19, 20, 21].
Таким образом, существующие данные о иммунологической и функциональной роли неструктурных белков NS2A, NS2B, NS3 флавивирусов свидетельствуют о необходимости их включения в рекомбинантную вакцину против ВКЭ.
Технической задачей изобретения является создание штамма рекомбинантного ВОВ, обеспечивающего значительный протективный эффект против ВКЭ при иммунизации.
Повышение протективных свойств рекомбинантного ВОВ осуществляется за счет введения в целевую конструкцию, кроме структурных генов C, prM, E и неструктурного гена NS1, также комплекса неструктурных генов NS2A-NS3.
Решение технической задачи осуществляется путем конструирования плазмиды интеграции pC-NS3, обеспечивающей встройку фрагмента кДНК ВКЭ, который кодирует полипептид C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3, в геном ВОВ.
Плазмида состоит из:
фрагмента кДНК ВКЭ штамма Софьин;
синтетического фрагмента ДНК, содержащего сайт терминации трансляции;
промотора ВОВ;
плазмидного вектора, обеспечивающего встройку чужеродных генов в ген тимидинкиназы (tk-ген) ВОВ.
В качестве фрагмента кДНК ВКЭ используется фрагмент ДНК длиной 6322 п.н. , включающий комплекс генов C (за исключением кодонов первых трех а.к.), prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3.
В качестве сайта инициации трансляции используется синтетический фрагмент ДНК длиной 21 п.н., имеющий структуру:
Данный синтетический фрагмент включает кодоны первых трех аминокислот гена C.
В качестве промотора ВОВ используется ClaI-BamHI-фрагмент ДНК плазмиды pVAR-15 длиной 270 п.н., содержащий ранне-поздний промотор ВОВ p7.5k [22].
В качестве сайта терминации трансляции используется синтетический фрагмент ДНК длиной 16 п.н., имеющий структуру:
В качестве плазмидного вектора, обеспечивающего встройку чужеродных ДНК в tk-ген ВОВ, используется плазмида pTK1614 [23].
Полученную плазмиду интеграции pC-NS3 используют для введения комплекса генов C-NS3 ВКЭ под контролем промотора ВОВ p7.5k в состав генома ВОВ штамма ЛИПВ в процессе контрансфекции плазмидной и вирусной ДНК клеток культуры CV-1. В результате гомологичной рекомбинации между ДНК плазмиды интеграции и ВОВ получен штамм рекомбинантного ВОВ kv26, в состав генома которого вошли гены C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3 ВКЭ.
Сущность изобретения заключается в том, что экспрессия комплекса генов C-NS3 ВКЭ в составе рекомбинантного вируса осповакцины kv26 в клетках иммунизированного организма детерминирует синтез антигенов ВКЭ, вызывающих формирование протективного иммунитета против заражения вирулентным штаммом ВКЭ. Значительный протективный эффект достигается за счет введения в рекомбинантный штамм ВОВ оптимального набора генов ВКЭ.
Морфология, признаки штамма
Рекомбинантный штамм kv26 обладает свойствами типичного представления семейства ортопоксвирусов. Вирионы штамма kv26 имеют размер 200х300 нм, характерную брикетообразную форму и по данным электронной микроскопии не отличаются от исходного штамма ЛИВП.
Культуральные свойства штамма
При размножении в монослое перевиваемых культур клеток CV-1, Rat-2(TK-) kv26 вызывает цитопатическое действие и лизис инфицированных клеток. В отличие от штамма ЛИВП обладает TK--фенотипом - способен к размножению на клетках Rat-2(TK-) в присутствии 25 мкг/мл бромдезоксиуридина. При заражении 12-суточных развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) от кур породы леггорн в дозах 101 - 102 оспинообразующих единиц (ООЕ) вызывает формирование на хорисаллантоисных оболочках (ХАО) белых плотных поражений (оспин) диаметром от 0,5 до 3-х мм. При накожном заражении кроликов и телят вызывает типичные вакцинальные поражения.
Вирулентные и токсикогенные свойства
Штамм kv26 безвреден в тесте на морских свинках и белых беспородных мышах. При внутримозговом введении кроликам в дозе 5•104 ООЕ и мышам в дозе 1•104 ООЕ не вызывает гибели животных. При внутрикожном введении кроликам в дозе 5•105 ООЕ не вызывает образование некрозов.
ДНК штамма kv26 имеет длину около 180 тыс.п.н., при этом вместо HindIIIK-фрагмента (5000 п.н.) штамма ЛИВП появляются три новых HindIII-фрагмента длиной 2800 п.н., 4250 п.н. и 4575 п.н. Фрагменты 2800 п.н. и 4575 п. н. по данным ДНК-ДНК блот-гибридизации содержат кДНК ВКЭ.
Основным отличием штамма kv26 от ЛИВП является способность обеспечивать защиту мышей при заражении ВКЭ. Высокая степень защиты мышей линии Balb/c при заражении вирулентным тест-штаммом ВКЭ была отмечена на 21 сутки после однократной иммунизации вирусом kv26 и значительно превосходила степень защиты мышей при заражении ВКЭ после иммунизации штаммом-прототипом wr7.5CMENS1 в аналогичных условиях.
Штамм описанного рекомбинантного штамма ВОВ kv26 депонирован в Государственной коллекции вирусных штаммов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером ГКВ N 945.
Таким образом, впервые получен штамм рекомбинантного ВОВ, экспрессирующий комплекс генов C-NS3 ВКЭ и детерминирующий синтез антигенов ВКЭ, обеспечивающих значительный протективный эффект против КЭ.
Изобретение иллюстрируется следующим графическим материалом: на чертеже дана схема плазмиды интеграции pC-NS3 и способ ее конструирования.
Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже следуют примеры его осуществления.
Пример 1. Способ конструирования плазмиды интеграции pC-NS3. 50 мкг ДНК плазмиды p10+4 с клонированным фрагментом кДНК ВКЭ длиной 2100 п.н., кодирующим структурные белки ВКЭ, расщепляют BglI-рестриктазой в стандартных условиях [24, 25]. BglI(137н.)-BglI(1211н.)-фрагмент кДНК ВКЭ длиной 1074 п.н. , включающий гены C, prM(M) и начало гена E ВКЭ, выделяют методом электрофореза в агарозном геле с последующей электроэлюцией на диализную мембрану [24]. Нумерация нуклеотидных остатков генома ВКЭ приводится в соответствии с данными Плетнева и соавт. [24].
Кроме того, из плазмиды p10+4 выделяют BglI(1211н.)-EcoRI(1914н.)-фрагмент гена E длиной 703 п.н. Выделенные фрагменты лигируются в стандартных условиях с вектором и синтетическим фрагментом ДНК, включающим сайт инициации трансляции и имеющим следующую структуру [25]:
В качестве вектора используется плазмида pVAR-15, гидролизованная по BamHI- и EcoRI-сайтам. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E. coli HB101. Искомые клоны определяют по появлению фрагмента ДНК длиной 1800 п. н. при совместном гидролизе рестриктазами BamHi и EcoRI. Полученную плазмиду, названную pCME(316), далее используют при конструировании плазмиды pC-NS1.
Для получения плазмидной конструкции pC-NS1 используются клоны, предоставленные Плетневым А.Г. (НИВХ СОРАН) p10+4, p18 [23]. Из клонов выделяют следующие фрагменты:
1. EcoRI(1914н. )-HinfI(2131н. )-фрагмент длиной 217 п.н. из плазмиды p10+4.
2. HinfI(2131н.)-HinfI(2383н.)-фрагмент длиной 252 п.н. из плазмиды p18.
3. HinfI(2383н.)-FokI(2497н.)-фрагмент длиной 114 п.н. из плазмиды p18.
Выделенные фрагменты, включающие 3'-конец гена E и 5'-конец гена NS1, лигируют с FokI-гидролизатом SalGI-EcoRI фрагмента, выделенного из плазмиды pBR327NS1' и содержащего последовательность гена NS1 [26]. При этом происходит SalGI-FokI(2497н.)-района SalGI-EcoRI фрагмента длиной 47 п.н. на фрагмент EcoRI(1914н. )-FokI(2497н. ) длиной 583 п.н., а также восстановление целостности оставшейся последовательности SalGI-EcoRI-фрагмента.
Кроме того, в лигазную смесь одновременно добавляют вектор pCME(316), гидролизованный по EcoRI-сайту. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E. coli HB101. Искомые клоны отбирают по наличию EcoRI(1914)-EcoRI фрагмента длиной 1783 п.н. Правильность сборки и ориентацию определяют по появлению фрагментов длиной 1986 п.н. и 2991 п.н. при гидролизе BglI-рестрактазой.
Полученную плазмиду pC-NS1 используют при конструировании целевой плазмиды pC-NS3.
В качестве источника неструктурных генов NS2A, NS2B и NS3 используют плазмиды pBR-NS2 и pGEM2-NS3 [27].
Для получения плазмидной конструкции pBR-NS2 используются клоны, предоставленные Плетневым А.Г. (НИВХ МОРАН) p8, p15 и p6 [24]. Из клонов выделяют следующие фрагменты:
1. HindIII(3673н. )-NcoI(4186н.)-фрагмент длиной 513 п.н. и NcoI(4186н. )-HhaI(4291н.)-фрагмент длиной 105 п.н. из плазмиды p8.
2. HhaI(4291н.)-SacI(4915н.)-фрагмент длиной 624 п.н. из плазмиды p15.
3. SacI(4915н.)-SalGI(5118н.)-фрагмент (203 п.н.) из плазмиды p6.
Фрагменты лигируют в стандартных условиях с векторной плазмидой pBR 322, гидролизованной по HindIII и SalGI сайтам. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli HB101. Искомые клоны определяют по появлению фрагмента длиной 1445 п.н. в совместном HindIII-SalGI-гидролизате плазмидной ДНК.
Из полученной плазмиды pBR-NS2 выделяют фрагмент HindIII(3673н.)-SalGI(5118н.) длиной 1446 п.н., содержащий последовательность генов NS2A и NS2B и 5'-концевую часть гена NS3. Фрагмент лигируют с SalGI(5118н.)-HindIII-фрагментом плазмиды pGEM2-NS3 длиной 1356 п.н., содержащим 3'-концевую часть гена NS3 и синтетический фрагмент ДНК длиной 16 п.н., включающий сайт терминации трансляции и имеющий структуру:
Лигазную смесь гидролизуют эндонуклеазной рестрикции HindIII и выделяют HindIII(3673 п. н.)-HindIII-фрагмент длиной 2801 п.н., который используют в качестве источника комплекса генов NS2A-NS3.
Для получения целевой плазмиды pC-NS3 плазмидную ДНК pC-NS1 гидролизуют ClaI, HindIII рестриктазами. Выделенный фрагмент длиной 3850 п.н., содержащий промотор p7.5k и гены C, M, E, NS1, лигируют с вектором pTK1614, гидролизованным по ClaI и HindIII сайтам. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E. coli HB101. Искомые клоны определяют по появлению фрагмента ДНК длиной 3850 п. н. при совместном гидролизе ClaI и HindIII рестриктазами. Полученную плазмиду pTKC-NS1 гидролизуют эндонуклеазой рестрикции HindIII и лигируют с HindIII(3673н.)-HindIII-фрагментом, несущим гены NS2A, NS2B, NS3 и сайт терминации трансляции. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E. coli HB101. Искомые клоны определяют по появлению фрагментов длиной 3950, 3850 и 2800 п.н. в совместном Cla-HindIII-гидролизате плазмидной ДНК. Полученную таким образом плазмиду обозначают pC-NS3 и используют для интеграции комплекса генов C-NS3 с геном ВОВ при получении рекомбинантного штамма kv26.
Пример 2. Получение рекомбинантного вируса осповакцины kv26.
Введение чужеродной ДНК в состав генома штамма ЛИВП ВОВ осуществляют по общепринятой методике котрансфекции плазмидной и вирусной ДНК клеток культуры CV-1, инфицированных ВОВ штамма ЛИВП [28]. Встройку комплекса генов C-NS3 ВКЭ проводят в HindIIIK-фрагмент ДНК ВОВ. Культуральные сосуды с монослоем клеток CV-1 (20 см2) заражают ВОВ с множественностью 0,05-0,1 ВОЕ/кл. Адсорбцию вируса на клетках проводят в течение 1 ч при 37oC, затем удаляют неадсорбированный вирус и клетки покрывают поддерживающей средой Игла МЕМ, содержащей 2% эмбриональной сыворотки и 80 ед/мл гентамицина. Через 1 ч инкубации при 37oC поддерживающую среду сливают и на клетки наносят по 0,5 мл кальций-фосфатного преципитата, содержащего 1 мкг ДНК плазмиды интеграции и 20 мкг ДНК ВОВ, и инкубируют при комнатной температуре. Через 45 мин после нанесения преципитата клетки покрывают 4,5 мл среды Игла МЕМ, содержащей 8% эмбриональной сыворотки и 80 ед/мл гентамицина, и инкубируют в течение 18-24 ч. Клетки после трансфекции замораживают, оттаивают и клонируют вирусное потомство на клетках перевиваемой культуры Rat-2(TK-) под агаровым покрытием, содержащим 25 мкг/мл ВДУ. Через 48 ч инкубации при 37oC в атмосфере, содержащей 5% CO2, наносят второе покрытие, содержащее 0,01% красителя нейтрального красного. Окрашивание монослоя клеток для визуализации вирусных бляшек проводят в течение 3 ч при 37oC в атмосфере, содержащей 5% CO2. Вирусные клоны, полученные из отдельных бляшек, поддерживают в 24-луночных пластиковых платах (диаметр лунки 16 мм) и анализируют методом ДНК-ДНК дот-гибридизации с меченным α -P32-фрагментом кДНК ВКЭ на наличие последовательностей кДНК ВКЭ.
Отобранный с помощью дот-гибридизации клон рекомбинантного ВОВ подвергают повторному клонированию. Для этого суспензию вируса обрабатывают ультразвуком 1 мин, фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и раститровывают на клетках Rat-2(TL-) под агаровым покрытием, содержащим 50 мкг/мл ВДУ, как описано выше. Отдельную вирусную бляшку отбирают и нарабатывают вирус ХАО РКЭ.
Из очищенного препарата рекомбинантного вируса выделяют ДНК [28, 29] и исследуют ее методом рестрикционного анализа. Проведенный рестрикционный анализ свидетельствует, что встройка кДНК ВКЭ произошла в HindIIIK-фрагмент (5000 п.н.) генома ВОВ (штамм ЛИВР), о чем свидетельствует исчезновение этого фрагмента в гидролизате ДНК рекомбинантного вируса и появление новых HindIIIK-фрагментов длиной 2800 п. н. , 4250 п.н. и 4575 п.н. О правильности встройки также свидетельствует совпадение электрофоретической подвижности фрагментов длиной 2800 п.н. и 3368 п.н. соответственно в HindIII и PstI - гидролизатах ДНК плазмиды pC-NS3 и рекомбинантного штамма.
Полученный рекомбинантный штамм ВОВ был обозначен как kv26, лиофильно высушен и депонирован в Государственной коллекции вирусных штаммов (депонент ГКВ N 945 от 02.07.92 г.).
Пример 3. Изучение протективной активности рекомбинантного штамма kv26.
В качестве экспериментальной модели используют мышей линии Balb/c 10-12 г веса. Иммунизацию штаммом ЛИВП и рекомбинантными штаммами kv26 и wr7.5CMENS1 проводят методом накожной скарификации основания хвоста мышей. Препарат наносят в объеме 5 мкл, что составляет 107 ООЕ.
В качестве положительного контроля берут мышей, иммунизированных инактивированной культуральной вакциной КЭ производства ТОМНИИВС внутрибрюшинно по 0,1 мл на мышь.
В качестве вирулентного тест-штамма ВКЭ берут штамм Абсеттаров, который используется в течение 30 лет для лабораторной оценки на мышах иммуногенной активности вакцин против клещевого энцефалита.
Заражение мышей ВКЭ проводят внутрибрюшинно десятикратными разведениями вируса (от 2,0 до 7,6 lg LD50) в дозе 0,1 мл через 21 день после иммунизации. Каждым разведением вируса инфицируют 8-10 мышей. В качестве контроля тест-штамма используют интактных мышей того же возраста, на которых титруют вирус. Павшие животные учитываются ежедневно в течение 2 недель после заражения. Мыши, умершие в первые 3 дня, не учитываются. LgKD50 вычисляют по методу Рида и Менча [31]. Протективность определяют по индексу резистентности (RI). RI вычисляют по разности lgLD50 в контрольной и экспериментальных группах животных.
Каких-либо отклонений в поведении животных после иммунизации не отмечалось. Специфическая гибель животных после введения тест-штамма вируса КЭ отмечалась на 6 сутки, что соответствует известному сроку инкубации вируса клещевого энцефалита.
Результаты определения протективных свойств рекомбинантных штаммов ВОВ, выраженные в LD50 и RI для каждой группы иммунизированных мышей, представлены в таблице. Индекс резистентности для мышей иммунизированных штаммом kv26 составил 7,0, что означает, что животные были полностью защищены против заражения ВКЭ в дозе 107LD50. Достигнутый уровень протективности сравним с уровнем защиты при иммунизации коммерческой инактивированной вакциной КЭ и значительно выше, чем при иммунизации штаммом-прототипом wr7.5CMENS1 (RI= 4.0).
Таким образом, впервые получен штамм рекомбинантного ВОВ, экспрессирующий комплекс C-NS3 ВКЭ и детерминирующий синтез антигенов ВКЭ, обеспечивающих значительный протективный эффект против КЭ.
Литература
1. Смородинцев А.А., Дубов А.В. Клещевой энцефалит и его вакцинопрофилактика. Ленинград: Медицина, 1986.
2. Mackett M., Smith G.L. J. Gen. Virol., 1986, v. 67, pp. 2067-2082.
3. Moss B., Sciens, 1991, v. 252, pp. 1662-1667.
4. Moss B., In: Seminars in Virology, Vol. 3, Academic Press Ltd., 1992, pp. 277-283.
5. Bray M. et al., J. Virol., 1989, v. 63, pp. 2853-2856.
6. Men R., Bray M. and Lai C.-J., J. Virol., 1991, v. 65, pp. 1400-1407.
7. Falgout B. et al., J. Virol., 1990, v. 64, pp. 4356-4363.
8. Schlesinger J.J., Putnak J.R. and Eckels K.H. In: Vaccines: New Approaches to Immunological Problems. R.W.Ellis, ed., Butterworth-Heinemann, Boston, MA., 1992, pp. 289-307.
9. Konishi E. et al., Virology, 1992, v. 190, pp. 454-458.
10. Авт.св. СССР N 1490963, кл. C 12 N 15/00, БИ N 25, 1993 г.
11. Патент РФ 1788012, кл. C 12 N 15/00, 1993 г.
12. Rice C. M. , Strause E.G. and Strause J.H. In: The Togaviridae and Flaviviridae. Schlesinger S. and Schlesinger M.J., eds., Plenum Press, New York, 1986, pp. 279-327.
13. Putnak R., In: Modern Vaccinology. E.Kurstak, ed., Plenum Medical, New York, 1994, pp. 231-252.
14. Konishi E., Virology, 1992, v. 188, pp. 714-720.
15. Sato T. et al., Virology, 1993, v. 192, pp. 283-490.
16. Yamshchicov V.F. and Compans R.W., Virology, 1993, v. 192, pp. 38-51.
17. Kurane I. et al., J. Clin. Invest., 1989, v. 83, pp. 506-513.
18. Kurane I. et al., J. Virol., 1991, v. 65, pp. 1823-1828.
19. Bukowski J.F. et al., J. Virol., 1989, v. 63, pp. 5086-5091.
20. Rothman A.L. et al., J. Virol., 1989, v. 63, pp. 2486-2491.
21. Rothman A.L. et al., J. Virol., 1993, v. 67, pp. 801-806.
22. Фодор И.И. и др., Биотехнология. 1987, т. 3, N 3, с. 302-306.
23. Приходько Г.Г. Структурно-функциональные исследования генов вируса осповакцины штамма ЛИВП. Диссерт. на соискание уч. степени кандидата биол. наук в форме науч. доклада, Новосибирск, 1990.
24. Pletnev A.S., Yamshchikov V.F., Blinov V.M., Virology, 1990, v. 174, N 1, pp. 250-263.
25. Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1989.
26. Пугачев К. В. , Плетнев А.Г. Мол. биол., 1990, т. 24, вып. 6, с. 1631-1639.
27. Pugachev K.V. et al., FEBS, 1992, v. 297, N 1, 2, pp. 67-69.
28. Smith G.L., Mackett M., Moss B., Nature, 1983, N 302, pp. 409-495.
29. Nakano E. , Panicali P., Paoletti E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, pp. 1533-1536.
30. Joklick W.K., Virology, 1962, v. 18, N 1, pp. 9-18.
31. Reed, L.J. and Muench H., Amer. J. Hyg., 1938, v. 37, pp. 493-497.
Изобретение относится к области генетической инженерии и биотехнологии, в частности, к получению рекомбинантной плазмидной ДНК рС-NS3, обеспечивающей интеграцию комплекса генов C, prM, E, NSI, NS2A, NS2B, NS3 вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) в геном вируса осповакцины (ВОВ), и соответствующего штамма ВОВ. Плазмида также содержит промотор р7, 5К ВОВ, синтетические фрагменты ДНК с сайтами инициации и терминации трансляции и последовательность ДНК гена тимидинкиназы ВОВ. Полученную плазмидную ДНК рС-NS3 используют для введения комплекса генов С-NS3 ВКЭ в геном ВОВ. Рекомбинантный ВОВ в клетках иммунизированного организма обеспечивает экспрессию комплекса антигенов ВКЭ, что способствует формированию протективного иммунитета против заражения ВКЭ. 2 с.п.ф-лы, 1 табл., 1 ил.
Bg l I -Alu I - фрагмент кДНК ВКЭ длиной 6322 п.н., кодирующий комплекс генов C (за исключением кодонов первых трех аминокислот), pr M, E, NS 1, NS 2A, NS 2B, NS 3;
Bam H I-Bg l I - синтетический фрагмент ДНК (21 п.н.), имеющий структуру
,
кодирующий эффективный сайт инициации трансляции и первые три аминокислоты полипротеина ВКЭ;
Bam H I-Hind III - синтетический фрагмент ДНК (16 п.н.), имеющий структуру
кодирующий сайт терминации трансляции;
Cla I-BamH I - фрагмент ДНК плазмы pVAR-15 длиной 270 п.н., содержащий ранне-поздний промотор ВОВ p.7.5к;
плазмидный вектор рТК6 14, линеаризованный по сайтам Cla I, Hind III и содержащий ген устойчивости к ампициллину и сайт инициации репликации плазмиды pBR322, а также нуклеотидную последовательность гена тимидинкиназы ВОВ,
фрагменты содержат следующие генетические маркеры:
bla - (ген β- лактамазы), определяющий устойчивость к ампиллицину при трансформации E.coli;
tк - прерванный ген тимидинкиназы ВОВ, обуславливающий ТК- фенотип при трансформации ТК+ ВОВ;
уникальные сайты для эндонуклеаз рестракции:
Cla I - сайт между последовательностью гена тимидинкиназы и последовательностью 7.5к промотора;
Xba I - сайт между последовательностью кДНК ВКЭ и последовательностью гена тимидинкиназы.
| SU, авторское свидетельство 1490963, кл | |||
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
| SU, авторское свидетельство, 1788012, кл | |||
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
