СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА Российский патент 2003 года по МПК A61K39/12 C12N7/02 C12N7/02 C12R1/92 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при получении культуральных вакцин клещевого энцефалита (КЭ).

Вакцина клещевого энцефалита может быть изготовлена на основе культуральных вирусных сборов, для получения которых используют первичные или перевиваемые клеточные культуры.

Согласно требованиям ВОЗ в вакцинах на основе перевиваемых клеточных культур жестко лимитируется содержание остаточной ДНК: оно не должно превышать 10 нг на 1 дозу вакцины для исключения потенциальной возможности ее онкогенного и трансформирующего действия.

Содержание гетерологичных белков в вакцине регламентируется Национальным Органом Контроля страны-производителя. При получении вакцины клещевого энцефалита с использованием первичной культуры клеток куриных эмбрионов существуют ограничения по содержанию в конечном продукте таких гетерологичных белков, как белки сыворотки крови крупного рогатого скота и белки куриного эмбриона. Согласно требованиям Национального Органа Контроля медицинских иммунобиологических препаратов - Государственного института стандартизации и контроля им. Л. А.Тарасевича (ГИСК им Л.А.Тарасевича) содержание гетерологичных белков в вакцине клещевого энцефалита должно быть не более 1 мкг/дозу.

Известен способ получения культуральных вакцин КЭ, предусматривающий заражение вирусом культуры клеток с последующей репродукцией и выходом вируса в культуральную среду, его инактивированием, выделением, очисткой и сорбцией на адъюванте (пат. SU 1003738, кл. А 61 К 39/12, 22.12.78).

Использование этого способа получения вирусной суспензии как в суспензионной, так и в монослойной культуре клеток куриных эмбрионов связано с достаточно высоким накоплением в ней белков куриного эмбриона.

Задачей предлагаемого способа является получение высокоиммуногенной очищенной вакцины клещевого энцефалита, снижение количества белков куриного эмбриона в вакцине клещевого энцефалита, полученной известным методом на культуре клеток куриных эмбрионов.

Поставленная задача достигается тем, что заявляемый способ предусматривает заражение вирусом КЭ культуры клеток с последующей репродукцией и выходом вируса в культуральную среду, его инактивированием, очисткой и сорбцией на адъюванте. На стадии репродукции в культуральную среду добавляют куриный экстракт, добавление протаминсульфата осуществляют в неосветленную инактивированную культуральную среду, концентрирование инактивированного вируса осуществляют ультрафильтрацией после осветления культуральной среды проточным центрифугированием и фильтрацией, очистку концентрированного вируса проводят хроматографией на диолмодифицированном сорбенте. Куриный экстракт используют с конечной концентрацией в среде от 0,5 мкг/мл до 1 мкг/мл. Протаминсульфат добавляют в неосветленную культуральную среду до конечной концентрации от 50 до 100 мкг/мл. Осветление культуральной вируссодержащей среды центрифугированием проводят после добавления в среду формальдегида и протаминсульфата. Осветление проводят на проточной центрифуге с ускорением от 12000 до 15000 g с последующей фильтрацией через пакет фильтров с конечным размером пор 0,45 мкм. Полученный таким образом полуфабрикат концентрируют в 30-50 раз ультрафильтрацией на синтетических фильтрах или трековых мембранах с диаметром пор от 40 до 60 нм. Далее концентрат очищают гель-хроматографией на колонке с макропористым кремнеземом. Кремнезем используют с порами диаметром от 50 до 100 мкм.

Предложенный способ осуществляют следующим образом.

Вирусный сбор (вирусную суспензию) получают путем репродукции вируса в суспензионной первичной культуре клеток куриных эмбрионов. Для увеличения репродукции добавляют куриный экстракт. Культивирование проводят в бутылях объемом 6,0 л в течение 4-х суток при температуре 36-37^oС при непрерывном перемешивании на роллерной установке со скоростью вращения 8-10 об/мин. Затем вирусную суспензию инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 200 ± 20 мкг/мл в течение 3-х суток при температуре (32±1)^oС. Концентрацию инфекционного вируса в вирусной суспензии контролируют до инактивации, а инактивированную вирусную суспензию контролируют на отсутствие вирусной активности. Перед объединением культуральную среду, содержащую клеточный дебрис, вирусную взвесь и клетки с вирусом, обрабатывают протаминсульфатом, затем вирусный сбор центрифугируют, объединяя в общую емкость, и фильтруют для освобождения от клеточного субстрата. Операцию производят следующим образом: в инактивированную вирусную суспензию добавляют 4%-ный раствор протаминсульфата до конечной концентрации 50-100 мкг/мл. Оставляют для взаимодействия при температуре (6±2)^oС на 0,5-12 часов. Далее преципитат удаляют последовательным центрифугированием полуфабриката из отдельных емкостей на проточной центрифуге ОТР-101К-01 при ускорении ~13000g с последующей фильтрацией объединенного полуфабриката через пакет фильтров с конечным размером пор 0,45 мкм. Полученный таким образом объединенный полуфабрикат концентрируют в 30-50 раз ультрафильтрацией на синтетических или асимметричных трековых мембранах. Концентрат дополнительно очищают хроматографией на колонке с модифицированным пористым кремнеземом. Тип сорбента - диол кремнезем или кремнезем, модифицированный поливинилпирролидоном. В собираемой хроматографической фракции контролируют антигенную активность вируса клещевого энцефалита, количество общего белка и белков куриного эмбриона. Затем полученный очищенный концентрат фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм, разводят в соответствии с его антигенной активностью и используют для приготовления сорбированной вакцины.

Пример 1.

Вирусную суспензию получают путем репродукции вируса (штамм ВКЭ 205) в суспензионной первичной культуре клеток куриных эмбрионов. Для увеличения репродукции добавляют куриный эмбриональный экстракт в конечной концентрации 1 мкг/мл. Культивирование вируса проводят в бутылях объемом 6,0 л в течение 4-х суток при температуре (37±1)^oC при непрерывном перемешивании на роллерной установке со скоростью вращения 8-10 об/мин. Затем вирусную суспензию инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 200±20 мкг/мл в течение 3-х суток при температуре (32±1)^oC. Концентрацию инфекционного вируса в вирусной суспензии контролируют до инактивации, а количество белков куриного эмбриона в полуфабрикате после инактивации. Далее следует стадия освобождения от клеточного субстрата и объединение полуфабриката. Операцию выполняют следующим образом: в бутыли с инактивированной культуральной средой, содержащей клеточный дебрис, вирусную взвесь и клетки с вирусом, добавляют протаминсульфат до конечной концентрации 50 мкг/мл. Оставляют для взаимодействия при температуре (6+2)^oС на 30-40 мин. Затем клеточный детрит и образовавшийся преципитат удаляют центрифугированием на проточной центрифуге ОТР-101К-01 при ускорении 13200 g. Сбор поступающего с центрифуги полуфабриката производят в общую емкость, затем его фильтруют через пакет фильтров с конечным размером пор 0,45 мкм. Полученный таким образом объединенный полуфабрикат концентрируют в 30 раз ультрафильтрацией на синтетических фильтрах. Далее концентрат очищают гель-хроматографией на колонке с пористым кремнеземом. Тип сорбента - диол кремнезем. В собираемой хроматографической фракции контролируют антигенную активность вируса клещевого энцефалита и количество белков куриного эмбриона. Затем полученный очищенный концентрат разводят равным количеством буферного раствора, фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной вакцины. Определение концентрации белков куриного эмбриона проводят методом встречного иммуноэлектрофореза.

Пример 2.

Вирусную суспензию получают путем репродукции вируса (штамм ВКЭ 205) в суспензионной первичной культуре клеток куриных эмбрионов. Для увеличения репродукции добавляют куриный эмбриональный экстракт в конечной концентрации 1 мкг/мл. Культивирование вируса проводят в бутылях объемом 6,0 л в течение 4-х суток при температуре (37±1)^oС при непрерывном перемешивании на роллерной установке со скоростью вращения 8-10 об/мин. Затем вирусную суспензию инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 200±20 мкг/мл в течение 3-х суток при температуре (32±1)^oС. Концентрацию инфекционного вируса в вирусной суспензии контролируют до инактивации, а количество белков куриного эмбриона в полуфабрикате после инактивации. Далее следует стадия освобождения от клеточного субстрата и объединение полуфабриката. Операцию выполняют следующим образом: в бутыли с инактивированной культуральной средой, содержащей клеточный дебрис, добавляют протаминсульфат до конечной концентрации 100 мкг/мл. Оставляют для взаимодействия при температуре (6+2)^oС на 12 час. Затем клеточный детрит и образовавшийся преципитат удаляют центрифугированием на проточной центрифуге ОТР-101К-01 при ускорении 15000 g. Сбор поступающего с центрифуги полуфабриката производят в общую емкость, затем его фильтруют через пакет фильтров с конечным размером пор 0,45 мкм. Полученный таким образом объединенный полуфабрикат концентрируют в 50 раз ультрафильтрацией на асимметричных трековых мембранах. Далее концентрат очищают гель-хроматографией на колонке с модифицированным пористым кремнеземом. Тип сорбента - диасорб-750-диол. В собираемой хроматографической фракции контролируют антигенную активность вируса клещевого энцефалита и количество белков куриного эмбриона. Затем полученный очищенный концентрат разводят соответствующим количеством буферного раствора, фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной вакцины. Определение концентрации белков куриного эмбриона проводят методом встречного иммуноэлектрофореза.

Пример 3.

Вирусную суспензию получают путем репродукции вируса (штамм ВКЭ 205) в суспензионной первичной культуре клеток куриных эмбрионов. Для увеличения репродукции добавляют куриный эмбриональный экстракт в конечной концентрации 1 мкг/мл. Культивирование вируса проводят в бутылях объемом 6,0 л в течение 4-х суток при температуре (37±1)^oС при непрерывном перемешивании на роллерной установке со скоростью вращения 8-10 об/мин. Затем вирусную суспензию инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 200±20 мкг/мл в течение 3-х суток при температуре (32±1)^oС. Концентрацию инфекционного вируса в вирусной суспензии контролируют до инактивации, а количество белков куриного эмбриона в полуфабрикате после инактивации. Далее следует стадия освобождения от клеточного субстрата и объединение полуфабриката. Операцию выполняют следующим образом: в бутыли с инактивированной культуральной средой, содержащей клеточный дебрис, вирусную взвесь и клетки с вирусом, добавляют протаминсульфат до конечной концентрации 75 мкг/мл. Оставляют для взаимодействия при температуре (6+2)^oС на 1 час. Затем клеточный детрит и образовавшийся преципитат удаляют центрифугированием на проточной центрифуге ОТР-101К-01 при ускорении 13200 g. Сбор поступающего с центрифуги полуфабриката производят в общую емкость, затем его фильтруют через пакет фильтров с конечным размером пор 0,45 мкм. Полученный таким образом объединенный полуфабрикат концентрируют в 40 раз ультрафильтрацией на синтетических фильтрах. Далее концентрат очищают гель-хроматографией на колонке с пористым кремнеземом. Тип сорбента - диасорб-1000-диол. В собираемой хроматографической фракции контролируют антигенную активность вируса клещевого энцефалита и количество белков куриного эмбриона. Затем полученный очищенный концентрат разводят соответствующим количеством буферного раствора, фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной вакцины. Определение концентрации белков куриного эмбриона проводят методом встречного иммуноэлектрофореза.

Пример 4.

Вирусную суспензию получают путем репродукции вируса (штамм ВКЭ 205) в суспензионной первичной культуре клеток куриных эмбрионов. Для увеличения репродукции добавляют куриный эмбриональный экстракт в конечной концентрации 1,5 мкг/мл. Культивирование вируса проводят в бутылях объемом 6,0 л в течение 4-х суток при температуре (37±1)^oС при непрерывном перемешивании на роллерной установке со скоростью вращения 8-10 об/мин. Затем вирусную суспензию инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 200±20 мкг/мл в течение 3-х суток при температуре (32±1)^oC. Концентрацию инфекционного вируса в вирусной суспензии контролируют до инактивации, а количество белков куриного эмбриона в полуфабрикате после инактивации. Далее следует стадия освобождения от клеточного субстрата и объединение полуфабриката. Операцию выполняют следующим образом: в бутыли с инактивированной культуральной средой, содержащей клеточный дебрис, вирусную взвесь и клетки с вирусом, добавляют протаминсульфат до конечной концентрации 70 мкг/мл. Оставляют для взаимодействия при температуре (6+2)^oС на 30-40 мин. Затем клеточный детрит и образовавшийся преципитат удаляют центрифугированием на проточной центрифуге ОТР-101К-01 при ускорении 13200 g. Сбор поступающего с центрифуги полуфабриката производят в общую емкость, затем его фильтруют через пакет фильтров с конечным размером пор 0,45 мкм. Полученный таким образом объединенный полуфабрикат концентрируют в 40 раз ультрафильтрацией на синтетических фильтрах. Далее концентрат очищают гель-хроматографией на колонке с макропористым кремнеземом. Тип сорбента - МПС-1000-ПВП. В собираемой хроматографической фракции контролируют антигенную активность вируса клещевого энцефалита и количество белков куриного эмбриона. Затем полученный очищенный концентрат разводят соответствующим количеством буферного раствора, фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной вакцины. Определение концентрации белков куриного эмбриона проводят методом встречного иммуноэлектрофореза.

Данная технология позволяет снижать количество белков куриного эмбриона с 10-16 мкг/мл в объединенном полуфабрикате до 1 мкг/мл и менее в очищенном полуфабрикате вакцины. При этом повышается эффективность производства вакцины клещевого энцефалита, так как в 2-2,5 раза снижается расход фильтров для осветляющей фильтрации вирусной суспензии и расход синтетических фильтров для последующего концентрирования ее ультрафильтрацией. Значительно сокращается время выполнения этих операций. Уменьшается количество операций, необходимых для получения вакцины из вирусной суспензии.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению вакцины. Процесс получения вакцины включает репродуцирование вируса в культуре клеток, его инактивирование, выделение, добавление протаминсульфата, очистку и сорбцию на гидроокиси алюминия. На стадии репродукции вируса в культуральную среду добавляют куриный экстракт. Добавление протаминсульфата осуществляют в неосветленную инактивированную культуральную среду без предварительного осветления. Концентрирование инактивированного вируса осуществляют ультрафильтрацией после осветления культуральной среды центрифугированием. А очистку концентрированного вируса проводят хроматографией на пористых кремнеземах. Хроматографически очищенную фракцию контролируют на содержание общего белка и белков куриного эмбриона, разводят буферным раствором в соответствии с его антигенной активностью и используют для получения сорбированной вакцины. Концентрация белков куриного эмбриона в очищенном полуфабрикате вакцины не превышает 1 мкг на дозу вакцины. Вакцина, полученная предложенным способом, содержит минимальное количество белков куриного эмбриона и обладает улучшенными антигенными свойствами. 7 з.п. ф-лы.

1. Способ получения вакцины клещевого энцефалита, предусматривающий заражение вирусом культуры клеток с последующей репродукцией и выходом вируса в культуральную среду, его инактивированием, выделением, добавлением протаминсульфата, очисткой и сорбцией на адъюванте, отличающийся тем, что на стадии репродукции вируса в культуральную среду добавляют куриный экстракт, добавление протаминсульфата осуществляют в инактивированную культуральную среду, содержащую клеточный дебрис, вирусную взвесь и клетки с вирусом, концентрирование инактивированного вируса осуществляют ультрафильтрацией после осветления культуральной среды центрифугированием, а очистку концентрированного вируса проводят хроматографией на модифицированном пористом кремнеземе. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что протаминсульфат добавляют в неосветленную культуральную среду до конечной концентрации от 50 до 100 мкг/мл. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осветление культуральной вируссодержащей среды центрифугированием проводят после добавления в среду формальдегида и протаминсульфата. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что взаимодействие культуральной суспензии с протаминсульфатом составляет 0,5-12 ч. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что осветление проводят на проточной центрифуге с ускорением от 12000 до 15000 g. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрирование проводят на синтетических или асимметричных трековых мембранах. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что асимметричные трековые мембраны используют с порами диаметром от 40 до 60 мкм. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что для очистки хроматографией используют модифицированный диол кремнезем.