СПОСОБ ОЦЕНКИ УРОЖАЙНОСТИ У ЗЕРНОВЫХ И ЗЕРНОБОБОВЫХ КУЛЬТУР Советский патент 1994 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к генетико- селекционным исследованиям и селекционной практике и может быть использовано в селекционных и любых других учреждениях биологического и сельскохозяйственного профиля для оценки селекционного материала, полученного методами половой гибридизации, мутагенеза, сомаклонального варьирования, генетической и клеточной инженерии на проявление признака урожайности зерна.

Цель изобретения - повышение точности оценки.

П р и м е р 1. Семена кукурузных линий W 64А (генотип-стандарт и Гб834 (исследуемый генотип) проращивают в термостате при 27^оС в темноте на влажной фильтровальной бумаге. Колеоптили трехдневных этиолированных проростков этих линий в количестве 20 г срезают и используются для выделения митохондрий методом дифференциального центрифугирования. Для этого срезанные побеги кукурузы помещают в предварительно охлажденный стакан гомогенизата, заливают ледяной средой выделения (соотношение навески побегов и среды 1: 4) и быстро измельчают ножницами. Растительную ткань с помощью пресса продавливают через небольшие отверстия в поршне гомогенизатора (диаметр отверстий 0,5 мм). Среда выделения содержит, М: сахарозу 0,3 М; KH₂PO₄ 0,018 (pH 7,2); ЭДТА 0,005, KCl 0,010; MgCl₂ 0,001; меркаптоэтанол 0,010.

Гомогенат фильтруют через капроновую ткань и центрифугируют при 2000g в течение 3 мин. Осадок отбрасывают, надосадочную жидкость центрифугируют 3 мин при 20 000g. Полученный осадок митохондрий тщательно промывают в 4 мл среды выделения, из состава которой исключен меркаптоэтанол (среда промывания). Время промывания составляет 3 мин. Среда промывания содержит дополнительно бычий сывороточный альбумин (10 мг/мл). Промытые митохондрии осаждают центрифугированием при 20 000g в течение 3 мин. Митохондриальный осадок ресуспендируют в 1 мл среды, содержащей 0,25 М сахарозу, 0,018 М KH₂PO₄ (pH 7,2), 0,1% бычий сывороточный альбумин. Концентрация белка в суспензии митохондрий составляет 10,5 мг/мл. Определение кинетики синтеза РНК в изолированных митохондриях каждой линии проводят с использованием меченого [³H] -уридинтрифосфата с удельной радиоактивностью 560 ТБк/моль в среде инкубации следующего состава, мМ: KH₂PO₄ (pH 7,2); 2 MgCl₂; 50 KCl; 4 сукцинат; 2 глутамат; 12 2-меркаптоэтанол; 2 АТФ; по 0,5 ГТФ, ЦТФ и 0,15 [³H] -УТФ. Пробы инкубируют в термостате при 30^оС в течение 5, 10, 15 и 20 мин. По окончании инкубации из реакционной среды отбирают аликвоты, содержащие 0,15 мг митохондриального белка в объеме 50 мкл, наносят на диски из хроматографической бумаги и фиксируют в охлажденном 10% -ном растворе триуксусной кислоты (ТХУ) не менее 20 мин. Затем диски дважды промывают холодной 5% ТХУ, многократно отмывают этанолом, высушивают и помещают во флаконы с 2 мл сцинтилляционного раствора, содержащего 6 г PPO, 800 мг РОРОР и 60 г нафталина на 1 л диоксана. Радиоактивность проб измеряют с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика радиоактивности. Скорость синтеза РНК в митохондриях выражают в тысячах импульсов за 1 мин на 1 мг белка. Результаты определения кинетики синтеза РНК в митохондриях генотипа - стандарта (линия W 64А) и исследуемого генотипа (линия Гб834) представляют в графической форме или в виде таблицы (представлены в таблице статистически обработанные данные трех независимых экспериментов с шестью параллельными определениями).

Урожайность зерна у линии W 64А (генотип-стандарт) и линии Гб834 (исследуемый генотип) по данным многолетних полевых испытаний соответственно 37,0 и 46,2 ц/га.

П р и м е р 2. Семена кукурузных линий W 64А (генотип-стандарт) и Cг25 (исследуемый генотип) проращивают в термостате при 27^оС в темноте на влажной фильтровальной бумаге в течение трех сут. Колеоптили этиолированных проростков в количестве 25 г срезают и используют для получения фракции изолированных митохондрий стандартным методом дифференциального центрифугирования. Конечный осадок митохондрий ресуспендируют с помощью стеклянного гомогенизатора в 1 мл буфера следующего состава, М: 0,25 сахара; 0,018 KH₂PO₃ (pH 7,2); 0,1% бычий сывороточный альбумин. Концентрация белка в суспензии митохондрий, определенная с помощью метода Лоури, составляет 10 мг/мл. Определение кинетики синтеза РНК в изолированных митохондриях каждой линии проводится с использованием меченого [³H] -уридинтрифосфата (УТФ) с удельной радиоактивностью 560 ТБк/моль в среде инкубации следующего состава, мМ: 40 KH₂PO₄ (pH7,2); 2 Cl₂; 50 KCl, 4 сукцинат; 2 глутамат, 12 2-меркаптоэтанол; 2 АТФ, по 0,5 ГТФ, 0,15 [³H] -УТФ. Пробы инкубируют в термостате при 30^оС в течение 5, 10, 15 и 20 мин. Из инкубационной среды отбирают аликвоты, содержащие 0,20 мг митохондриального белка в объеме 50 мкл, наносят на диски из хроматографической бумаги и фиксируют в охлажденном 10% -ном растворе трихлоруксусной кислоты (ТХУ) не менее 20 мин. Затем они дважды промывают холодной 5% ТХУ, многократно отмывают этанолом, высушивают и помещают во флаконы с 2 мл сцинтилляционного раствора, содержащего 6 г PPO, 800 мг POPOP и 60 г нафталина на 1 л диоксана. Радиоактивность измеряют с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика радиоактивности. Скорость синтеза РНК в митохондриях выражают в тыс. имп/мин^-1 (мг белка)^-1.

Кинетическая кривая синтеза РНК в митохондриях линии Cг25 располагается выше кривой, полученной для линии W 64А (стандарт), что позволяет сделать заключение о сниженной урожайности зерна у линии Cг25 по сравнению с урожайностью стандарта.

Урожайность зерна у линии W 64А (генотип-стандарт) и линии Cг25 (исследуемый генотип) по данным многолетних полевых испытаний составляет соответственно 37,0 и 28,6 ц/га.

П р и м е р 3. Семена гороха сорта "Тулунский зеленый" (стандарт) и сорта "Марат" (исследуемый генотип) проращивают в термостате при 27^оС в темноте на влажной фильтровальной бумаге в течение 4 сут. Колеоптили этиолированных проростков в количестве 25 г срезают и используют для получения фракции изолированных митохондрий методом дифференциального центрифугирования. Процедуры по определению кинетики синтеза РНК в изолированных митохондриях гороха с использованием препарата меченого [³H] -АТФ (молярная активность 370 ТБк/моль) были аналогичны описанным в примере 1. Кинетическая кривая синтеза РНК в митохондриях сорта "Марат" располагается ниже кривой, соответствующей кинетике синтеза мтРНК для стандартного генотипа, что дает основание заключить об увеличенной урожайности зерна у сорта "Марат" по сравнению с таковой у сорта-стандарта. По данным полевого эксперимента 1986 г. урожай зерна для сортов гороха "Тулунский зеленый" и "Марат", определенный для 100 растений, составил соответственно 185,9 и 244,2 г.

Благодаря широкому использованию в последнее время в учреждениях генетико-селекционного и биологического профиля методов отдаленной гибридизации, химического мутагенеза, генетической и клеточной инженерии, традиционной селекции резко возрастает число растительных генотипов, у которых требуется оценить признак урожайности зерна. Предлагаемый способ позволяет значительно сократить время, требующееся для оценки признака урожайности зерна у зерновых и зернобобовых культур, а также отказаться от значительных материальных затрат, связанных с использованием земельных площадей, семенного материала, минеральных удобрений, техники и людских ресурсов при проведении полевых экспериментов. Способ основан на сравнении биологических параметров у репрезентативной выборки для стандартных и испытываемого селекционных образцов, что дает возможность значительно ускорить селекционный процесс на продуктивность.

Отобранные с использованием предлагаемого способа новые растительные генотипы с увеличенной относительно стандарта урожайностью зерна могут быть далее включены в систему генетико-селекционных испытаний по классической схеме, что в конечном итоге позволит значительно сократить время внедрения высокопродуктивных зерновых и зернобобовых культур в народное хозяйство. (56) Авторское свидетельство СССР N 1344288, кл. A 01 H 1/04, 1986.

Изобретение относится к генетико-селекционным исследованиям и селекционной практике и может быть использовано в селекционных и любых других учреждениях биологического или сельскохозяйственного профиля для оценки селекционного материала, полученного методами половой гибридизации, мутагеноза, сомаклонального варьирования, генетической и клеточной инженерии, на проявление признака урожайности зерна. Цель - повышение точности оценки. Для осуществления способа в качестве биологического показателя измеряют величину скорости синтеза митохондриальной РНК у испытываемого генотипа и сортастандарта, при этом считают, что урожайность зерна связана отрицательной корреляционной зависимостью с измеряемым показателем. 1 табл.

СПОСОБ ОЦЕНКИ УРОЖАЙНОСТИ У ЗЕРНОВЫХ И ЗЕРНОБОБОВЫХ КУЛЬТУР, включающий проращивание семян и измерение показателя физиологического состояния растений, по значению которого судят об урожайности, отличающийся тем, что, с целью повышения точности оценки, в качестве показателя измеряют величину скорости синтеза митохондриальной РНК у испытываемого генотипа и генотипа - стандарта, при этом урожайность зерна связана отрицательной корреляционной зависимостью с измеряемым показателем.